8.2.3.7 分析条件的选择

(1)酶解

群勃龙和19-去甲睾酮在样品中往往与蛋白等物质稳定结合，文献多采用β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶水解。但酶解条件各有差异(包括酶的用量、酶解温度和时间、不同缓冲液体系及pH等)。实验发现牛奶和奶粉液样品在pH=5.0左右，用400个单位酶用量，在37℃酶解6个小时以上，分析物即可完全水解，回收率较高。

(2)提取净化

乙酸乙酯能有效地提取出样品中群勃龙和19-去甲睾酮的残留。但牛奶和奶粉为高蛋白样品，乙酸乙酯不能沉淀蛋白，提取溶液易乳化。乙腈能很好地沉淀蛋白，但提取效果不如乙酸乙酯，且浓缩时比较费时。试验发现5mL乙腈+20乙酸乙酯提取两次，能沉淀蛋白提高提取效率。

固相萃取技术是比较有效的净化手段，本方法对硅胶柱、C18柱、混合型柱、免疫亲和柱以及C18-氨基柱串联均做了实验，结果发现了C18柱、硅胶柱、混合型柱的净化效果均不佳，回收率不高。考虑到GPC对油脂蛋白等大分子有较好的去除能力，实验了GPC净化方法。标准和基质GPC色谱图见图8-12。由图8-12可知，目标化合物10～15min中可被流动相从GPC色谱柱中淋洗出来，所以设定GPC的程序为0～10min弃去林洗液，10～15min收集林洗液。这样就可以除去样品中的大部分杂质，尽管仍有部分干扰物存在但不影响组分的测定。

图8-12 混合标准溶液和牛奶基质的GPC色谱图

(3)仪器条件的选择

1)色谱柱和流动相的选择

a-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮为两对旋光异构体具有相同的分子量和特征碎片，所以色谱条件的分离成为了检测这两对异构体的必要手段。用0.1%的乙酸水溶液与乙腈作流动相，采用时间梯度洗脱，在InertsilODS-3(2.01mm×150mm，5μm)柱上，四种物质可有效分离。但对于两种规格的ZORBAXSB-C18(3.0mm×100mm，3.5um和2.1mm×150mm，5um)均不能使a、β-群勃龙完全分离。

2) 监测离子的确定

用蠕动泵以10uL/min注入1μg/mL的混合标准溶液来建立确定各化合物的最佳质谱条件，包括选择特征离子对，优化电喷雾电压、鞘气、辅助气、碰撞能量等质谱分析条件。分析物的混标液进入ESI电离源，在正、负离子扫描方式下分别对分析物进行一级全扫描质谱分析，得到分子离子峰。5种分析物均在正模式下有较高的响应，负模式下信号值很低。然后对各分子离子峰进行二级质谱分析(多反应监测MRM扫描)，得到碎片离子信息。其具体的质谱条件为：鞘气压力，30unit；辅助气压力，5unit；正离子扫描模式；电喷雾电压，4000V；毛细管温度，320℃；源内诱导解离电压，10V；Q1为0.4、Q3为0.7；碰撞气为高纯氩气，碰撞气压力为1.5mTorr。分析物的保留时间采集窗口确定定性定量离子对及碰撞能量见表8-24。