9.2.4.1 适用范围

适用于牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的液相色谱-串联质谱法测定。方法检出限：牛奶中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烷雌酚、己烯雌酚和双烯雌酚为1.0ug/L；奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烷雌酚、己烯雌酚和双烯雌酚为8.0μg/kg。

9.2.4.2 方法原理

牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留，用乙腈作为蛋白沉淀剂和提取剂进行提取，阴离子固相萃取柱进行净化，用液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。

9.2.4.3 试剂和材料

甲醇、乙腈：色谱纯；氨水、甲酸、氢氧化钠：分析纯。

5mol/L氢氧化钠溶液：称取200g氢氧化钠，用蒸馏水定容到1L。

淋洗液：氨水-水(1+19，v/v)；洗脱液：甲酸-甲醇(1+19，v/v)。

激素及代谢物标准物质：玉米赤霉醇(包括a-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇，各50%)纯度≥97%；玉米赤霉酮，纯度≥97%；己烯雌酚，纯度≥99%；己烷雌酚，纯度≥98%；双烯雌酚，纯度≥98%。

标准溶液：分别准确称取适量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚标准物质，用甲醇配制成1mg/mL标准贮备溶液。再根据需要以甲醇配制成不同浓度的混合标准溶液作为标准工作溶液，保存于4℃冰箱中。

内标标准物质：a-玉米赤霉烯醇-4氘代，纯度≥99%；己烯雌酚-8氛代，纯度≥98%。

内标标准溶液：准确称取适量玉米赤霉烯醇-4氘代和己烯雌酚-8氘代标准物质，用甲醇分别配制成1mg/mL标准贮备溶液。再以甲醇稀释成适用浓度的混合内标工作溶液，保存于4℃冰箱中。

基质标准工作溶液：将标准工作溶液及内标工作溶液混合后在氮吹仪中吹干，以基质提取液溶解，涡旋30s后即为基质标准工作溶液。

Oasis MAX 阴离子固相萃取柱或相当者：60mg，3mL。

9.2.4.4 仪器和设备

液相色谱-串联质谱联用仪：配有电喷雾电离源；自动固相萃取仪或固相萃取装置；氮气吹干仪；涡旋振荡器；离心机：转速大于3500r/min；高速离心机：转速大于9000r/min，温度可控制在4℃。

9.2.4.5 样品前处理

(1) 试样制备

牛奶：取50mL新鲜或解冻的牛奶混合均匀，3500r/min离心5min，取下层；奶粉：取12.5g奶粉于烧杯中，加适量35～50℃水将其慢慢溶解，转移至100mL容量瓶中，待冷却至室温，用水定容混匀。取50mL，以3500r/min离心5min，取下层。

(2) 样品量取

于50mL离心管中，分别加入不同量混合标准工作溶液，使各被测组分玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烷雌酚、己烯雌酚和双烯雌酚的浓度为2.5ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。再分别加入适量内标标准工作溶液，使其浓度均为10ng/mL，在氮吹仪上于40℃水浴中吹干。取5个阴性样品，每个样品为5mL，置于上述离心管中涡旋混合后，加10mL乙腈，涡旋混合3min，3500r/min离心10min，取上清液于离心管中，再向样品中加入5mL乙腈，同前操作，合并提取液，50℃下氮吹至体积小于0.1mL。加水10mL，用5mol/L NaOH调节pH至11.0，4℃，9000r/min离心5min，备用。

(3)提取净化

固相萃取净化条件：先用2mL甲醇、2mL水将柱子活化，流速均为4mL/min。将样品上清液上柱，流速为1mL/min，依次用1mL淋洗液、0.5mL甲醇以3mL/min的速度淋洗，通入20mL空气以4mL/min的速度吹过OasismAX柱。用4mL洗脱液洗脱，流速为1mL/min，加入30mL空气以6mL/min的速度吹过OasismAX柱，收集洗脱液。将洗脱液在氮吹仪上于40℃水浴中吹干，加入1mL流动相，涡旋30s溶解。溶液过0.2μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定。

(4) 基质提取液

空白样品，除不加入标准工作溶液和内标工作溶液外，其他操作同上述步骤处理后得到的溶液。

(5) 实测样品溶液的制备

取待测样品5mL于50mL离心管中，加入适量内标标准工作溶液，使其最终定容浓度均为10ng/mL按上述步骤操作。

(6) 空白基质溶液的制备

取阴性样品5mL于50mL离心管中，按上述步骤操作。

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