(2)提取方法

吡唑酮类药物在中性条件下最稳定，在酸、碱性条件下稳定性降低，应尽快处理，减少药物水解。该类药物的吡唑酮环，上的不饱和键易被氧化，提取溶剂中常加入二硫苏糖醇、维生素C等还原性稳定剂；同时，在操作中应尽量避免高温和光照，避免使用强酸或强碱性溶液。

1)液液萃取(liquid liquid extraction，LLE)

生物基质(血液、尿液、乳汁和组织)中吡唑酮类药物主要采用液液萃取(LLE)的方法进行提取。已报道的保泰松和/或羟布宗提取溶剂主要包括乙腈、乙酸乙酯、乙醚-正已烷、乙腈、酸性溶剂等；安替比林提取溶液有氯仿、硫酸钠-亚硫酸钠溶液等。吡唑酮类药物中氨基比林、安替比林和安乃近代谢物显碱性，而保泰松、羟布宗呈酸性，提取方法往往根据药物酸碱性进行，有所不同。

A.碱性药物

本类药物在酸碱性条件下易水解，应尽量在中性条件提取和净化；若选择酸碱性条件时，应尽快完成操作。

a.中性提取

沈金灿等测定牛和猪肌肉组织中残留安乃近的3种代谢物FAA、AA和MAA残留。为保持药物稳定性，选择pH 7.0的0.1 mol/L的Na2SO4提取，同时在提取溶液中加入抗氧化剂20 mmol/L的Na2SO3，防止氧化。HPLC测定FAA的LOD为12.5μg/L，AA为15.0 μg/L， MAA为20.0 μg/L；3种代谢物的LOQ均为50 ug/L；在添加水平50～400 μg/kg范围内，FAA的回收率为81.3%～92.5%，AA为82.0%～96.0%，MAA为80.4%～90.6%，相对标准偏差(RSD)均在7%以内。该方法用水性溶剂提取，提取液中杂质较多，对后续净化要求较高。

而采用有机溶剂/混合溶剂直接提取的报道较多。Penney等测定牛肉、猪肉中安乃近及其代谢物残留，用甲醇提取，液相色谱-质谱(LC-MS)测定。方法平均回收率为82%～128%，FAA、AA和MAA的LOD均小于0.02μg/g，安乃近LOD小于0.13μg/g。Inaba等测定尿液中安替比林及其代谢物，尿液酶解后用PBS缓冲液调节pH 7.4，用同等体积的乙酸乙酯提取4次，提取液蒸干后用氯仿复溶。Mikati等测定尿液中安替比林及其代谢物，尿液酶解后，用乙酸乙酯提取，提取液蒸干后用流动相复溶。张骊等测定猪肉中氨基比林、安替比林和安乃近代谢物残留，样品直接用乙腈提取，提取液高速离心后，取上清液直接液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)分析。猪肉中的LOD为2μg/g，LOQ为5μg/g；平均回收率为71.9%～100%；批内批间CV均小于10%。

b.碱性提取

在碱性条件下，氨基比林、安乃近、安替比林及其代谢物更易被有机溶剂提取。

沈金灿等测定牛奶和奶粉中安乃近的4个代谢物：FAA、AAA、MAA和AA残留。样品加入Tris溶液调节至碱性，再加入乙腈提取，提取液净化后用LC-MS/MS测定，AAA、FAA和AA采用外标法定量，MAA采用内标法定量。FAA的LOD为0.24μg/kg，AA为0.59μg/kg，AAA为0.20μg/kg，MAA为0.61μg/kg；在添加量5～20μg/kg范围内，4种代谢物的回收率在80.4%～97.9%之间，RSD均小于9%。牛奶中含有钙、镁等金属离子，容易与目标化合物形成络合物，影响样品的测定，在样品提取中加入保护剂以避免金属元素对这些化合物的干扰。实验发现，在加入乙腈提取液前，预先在牛奶样品中加入1.0mol/L的碱性Tris缓冲液，使其与样品中的金属形成氢氧化物沉淀，而安乃近各代谢物溶解在溶液中，这样降低了金属或其他物质的干扰。同时，牛奶样品中含有大量的蛋白质，能够与药物结合，在提取过程中形成泡沫、浑浊或出现沉淀而干扰测定，而乙腈也可以同时去除蛋白和脂肪。Katz等测定血浆中安乃近的4种代谢物，样品用氢氧化钠溶液碱化后用二氯甲烷提取，提取液蒸干复溶后用HPLC测定，以异丙基氨基安替比林为内标定量。FAA和AAA的校正回收率为96.0%～100%，MAA和AA为70.6%～87.8%，CV均低于6.7%，LOD为0.1μg/mL。

Shively等测定唾液中安替比林和氨基比林。1mL唾液样品中加入1mL 1mol/L氢氧化钠溶液碱化，再加入氯仿提取，离心后取氯仿层，蒸干后复溶于二氧六环，GC测定。安替比林和氨基比林的线性范围均为0～10μg/mL，CV为1.7%和2.4%，回收率为87%和95%。实验表明，碱化液体样品有助于安替比林和氨基比林转移至有机溶剂

Abernethy等提取血浆中安替比林，1 mL血浆中加入1mL 1 mol/L氢氧化钠溶液，再加入6 mL乙酸乙酯提取，离心，取乙酸乙酯层蒸干复溶后GC测定。方法LOD为1 μg/mL，回收率大于95%，CV小于6.6%。

c.酸性提取

也有在酸性条件下用有机溶剂萃取的报道。酸性条件萃取的优点是共萃取的组织基质较少，但应加大提取溶剂使用量，并使用极性稍强的有机溶剂，以提高萃取效率。

崔景斌等测定血浆中安乃近代谢物，取血浆0.5mL，加入内标物异丙氨基安替比林，用0.1mL 0.1mol/L的HCI酸化，加无水乙醚萃取，离心取醚层吹干，残留物用流动相溶解，HPLC测定。MAA的绝对回收率为82.5%，相对回收率为99%，CV小于3.66%。Jedziniak等测定牛肉中安乃近的4种代谢物FAA、AAA、AA和MAA残留。样品经乙腈-0.33mol/L乙酸钠(8+2，v/v)缓冲溶液提取，LC-MS测定。CV为7%～30%，回收率为45%～95%；FAA、AAA、AA和MAA的检测限(CCa)分别为11.6μg/kg、11.6μg/kg、12.6μg/kg和113μg/kg，检测能力(CCβ)分别为16.5μg/kg、15.8μg/kg、16.4μg/kg和139μg/kg。