17.1.4 残留分析技术

17.1.4.1 前处理方法

药物残留检测方法建立过程中前处理方法至关重要，样品净化的好坏不仅直接影响到方法的灵敏度和回收率，而且影响整个分析方法的用时和工作量。一般样品前处理过程包括提取和净化两个环节。BMZs属于弱碱性，在碱性条件下易溶于有机溶剂，所以对于常规的检测方法，样品前处理过程经常采用碱化的有机溶剂进行提取，经过正己烷除脂净化，然后过固相萃取柱再净化，此外也有使用离子对、基质固相分散技术、超临界流体萃取技术进行萃取净化的报道。

(1) 水解方法

水解是为了让与蛋白或共轭物上结合的BMZs残留物释放出来，或者使其变成其通常的分子结构。在BMZs残留分析中，绝大多数都采用了水解轭合物步骤。水解方法主要包括酶水解和酸水解等。酶水解时间较长，一般需过夜；酸水解加热数小时即可水解完全。

1)酶水解

酶水解通常将酶加到样品中，混匀，置于37℃水浴锅或摇床.上，缓慢震荡过夜酶解，然后再进行提取。依据不同的组织样品，常用的酶有β-葡萄糖醛酸酶、硫酸酯酶和蛋白酶等。酶解的操作比较简单，只是对温度有要求，一般需要过夜酶解，耗时较长。

Chuckwudebe等对蛋鸡和泌乳羊体内TBZ的代谢进行了详细研究。采用酶解的方法，发现排泄物、蛋、奶及其他可食用组织中TBZ轭合物主要以硫酸盐的形式存在。蜗牛酶水解法在0.1mol/L pH5的醋酸钠缓冲液中进行，硫酸酯酶水解法在0.05mol/L pH7的Tris缓冲液中进行，β-葡萄糖醛酸酶水解法在0.5mol/L pH7的磷酸钾缓冲液中进行。TBZ的代谢物TBZ-5-OH邻硫酸盐是在无β-葡萄糖醛酸酶的情况下，由其他两种酶水解而来。Vandenheuvel等在蓝腮太阳鱼研究中采用酶解的方法把TBZ-5-OH从轭合物中解离出来。用蜗牛酶和硫酸酯酶活性比为13.5：1，加入每个样品中，再加入一滴甲苯，37℃孵育过夜，然后将样品加热到60℃维持5min，用0.1mol/L乙酸钠溶液调至pH6.3，然后用乙酸乙酯提取鱼可食组织和内脏中的药物，两种组织中药物的回收率基本相同，均大于90%。Tocco等发现尿中TBZ代谢物主要以葡萄糖醛酸和硫酸盐结合的TBZ-5-OH的形式存在。因此，轭合物通常采用β-葡萄糖醛酸酶或葡萄糖苷酶水解方法，将1000单位的β-葡萄糖醛酸酶溶解到10mL pH6.5的索伦森缓冲液中，37℃孵育18h，再用乙酸乙酯提取水相中的TBZ-5-OH。酶解法证明了TBZ分子上一定有糖部分。Caprioli等采用蛋白酶对牛肝脏组织进行酶解。5g牛肝组织匀浆加15mL pH 3.0的磷酸缓冲液，然后再加1.5mL蛋白酶涡动混匀，用盐酸调至pH3.78，37℃过夜酶解。从结果来看，对于牛肝添加样品，酶解方法的回收率普遍没有不酶解的方法高。对于阿苯达唑等14种BMZs药物和代谢物中只有TBZ-5-OH的回收率为98%，大于没有酶解方法的95%；其余药物的回收率都没有不酶解方法的高，当然该方法的提取溶剂与不酶解的不同，所以对于酶解效果很难进行比较。

2) 酸水解

与酶水解相比，酸水解往往需要较高的温度(80～100℃)，但酸解的时间较短，一般约需数小时。许多残留检测方法都采用了酸解方法。

Markus等提取肝脏组织中ABZ代谢物时，采用酸解的方法使组织中的代谢物转化成ABZ-NH2-SO2。采用6mol/LHCl在110℃±4℃，15psi大气压下水解30min，1h后取出样品，室温冷却约5min。此方法回收率为101.7%±5.2%。Arenas等将5mL奶样用浓盐酸在85～90℃酸解4h，释放出与硫酸盐结合的TBZ-5-OH，酸解物用NaOH中和并调节pH至8.0，然后用乙酸乙酯提取，提取物用PRS阳离子交换柱净化，高效液相色谱(HPLC)检测。TBZ、TBZ-5-OH和与硫酸盐结合的TBZ-5-OH回收率分别大于87%、98%和96%。Tocco等也采用6mol/L HCI回馏1h，水解尿中硫酸盐结合的TBZ-5-OH，中和至pH6.0，然后再用乙酸乙酯提取。Chu等用阿苯达唑主要代谢产物ABZ-NH2-SO2作为残留标示物，建立了检测奶中ABZ代谢物残留的方法。奶样加磷酸于100℃水解1h，接着用SCX SPE柱净化。在这个过程中，酸解使ABZ-NH2-SO2游离出来。用反相HPLC定量检测残留标示物。该方法适用于ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO和ABZ-NH2-SO2结合物的检测，但不适用于ABZ、NETO或ABZ-SO的检测。结果显示，该方法能够检测奶牛给药后36～120h内奶中大于40%的ABZ残留；添加水平为25～200ng/mL时的回收率在91%～105%之间，重复分析试验的相对标准偏差(RSD)小于5%。

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