2.2.2.6测定

(1)液相色谱条件

色谱柱:Atlantis C18，3um，150mm×2.1mm(内径)或相当者;流动相:A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液，C为甲醇。梯度洗脱条件见表2-5;流速:0.2mL/min;柱温:35℃;进样量:20μL。

(2)质谱条件

离子源:电喷雾离子源:扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测;电喷雾电压:5500V;雾化气压力:0.076MPa;气帘气压力:0.069MPa辅助气流速:6L/min:离子源温度:350℃:定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表2-6。

(3)液相色谱-串联质谱测定

用基质标准工作溶液分别进样，以各标准峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，以各标准工作溶液浓度与内标溶液浓度的比值为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中18种磺胺的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，18种磺胺的保留时间见表2-6。18种磺胺的标准多反应监测(MRM)色谱图见图2-1。

2.2.2.7分析条件的选择

(1)样品提取液的选择

分别使用三个不同溶液作为蜂王浆样品提取液，在同一添加水平，相同实验条件下对蜂王浆样品进行回收率实验，实验数据见表2-10

表2-10 不同提取液回收率的比较(%)

从表2-10中数据可以看出，当用0.1mol/L盐酸作为提取液时，经过内标校正回收率在60.0%～369%之间，特别是磺胺吡啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺喹噁啉、磺胺苯酰和磺胺氯吡嗪的回收率均超过了150%。当用0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液时，经过内标校正回收率在34.7%～135.0%，特别是磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺喹噁啉和磺胺氯吡嗪的回收率均低于70%。当用水作为提取液时，经过内标校正，18种磺胺的回收率在78.8%～118.0%之间，整体上要好于0.1 mol/L盐酸和0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液，因此在本方法中选择水作为蜂王浆样品提取液。

(2)提取液pH的确定

对于建立兽药多残留前方法来说，选择合适的pH样品提取液是至关重要的，因为不同pH的目标物质过柱时要求其样液的pH也不同，为了找出磺胺类药物过Oasis MCX柱最佳pH，蜂王浆样品经三氯乙酸沉淀蛋白后，提取液的pH即为1.0，将提取液分别调至pH=1.0、pH=2.0、pH=3.0、pH=4.0四个不同的pH，在其他条件相同的情况下，进行回收率实验，实验数据列于表2-11。从表2-11可以看出，磺胺甲噻二唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶随着pH的增大，回收率越来越低，当pH=3.0时，其回收率低于70%，而在pH=1.0时，回收率均在80%以上，相对比较稳定，整体比较要好于其他三个水平。因此，在本方法中确定pH=1.0为样液过Oasis MCX柱时的最佳pH。

表2-11 不同pH提取液回收率的比较(%)