1.1.4.2测定方法

目前国内外用于检测动物源产品中β-受体激动剂的方法和手段逐渐增多，主要有感官识别、光谱分析、色谱分析、免疫分析和生物传感器技术等。

(1)感官识别法

可以从动物服体的颜色和品质上来判断。含有β-受体激动剂(特别是克伦特罗)的肉色较深，较鲜艳，脂肪层非常薄，在腹股沟的脂肪层内毛细血管分布较密，甚至呈充血状态。内脏实质器官(心、肝、肾)充血肿胀，用手指触之酥软呈脂肪变性；间质器官如肺、气管切面见泡沫、气肿等病变特征，有时有少量“汗水”渗出肉面。而健康肉呈淡红色，肉质弹性好，也不会有“出汗”现象。感官检验法可用于对含有β-受体激动剂动物源产品的粗略判断，主观性较强，可为消费者购买放心肉提供一定的参考。

(2)光谱分析技术(spectroscopy)

由于克伦特罗等β-受体激动剂溶于水和乙醇，可直接用水进行提取，而且克伦特罗等既可显芳香第一胺类的鉴别反应，也可显氯化物的鉴别反应。因此，采用分光光度计检测，可在243nm与296nm的波长处得到最大吸收峰。分光光度法在常温下有较好的稳定性。由于β-受体激动剂在生物样品中含量甚微，该方法检测限过高，达不到残留分析要求，目前只限于药品本身的常规分析。

(3)免疫分析技术(immunoassay)

免疫分析技术主要应用于动物源产品中β-受体激动剂残留样品的筛选，具有灵敏度和特异性高、快速简便，且一次能检测大量样品的特点。但在某些反应中有交叉反应，存在假阳性结果，以及对未知化合物不能测定，因此在实际应用中受到一定限制。

1)酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

ELISA的基本原理基于抗原抗体反应进行的测定。目前，国内外已研制出用于克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等β-受体激动剂残留检测的商品化ELISA试剂盒。该方法样品前处理简单，批量检测成本低，适合对活体动物做大批量样品的快速检测。欧盟等国家已将此作为“筛选法”，用于宰前尿检、血检及屠宰场的检疫。缺点是该法结果假阳性率较高，疑似阳性的样本需要用仪器方法确证。Sawaya等采用ELISA法从羊尿和羊眼组织样品中筛查残留克伦特罗的阳性样品。在尿样中最低检测限为0.272ng/g，在眼组织样中最低检测限为1.54ng/g。经GC-MS确证，所有筛选出的“阳性”样品均为阴性。但该方法具有很大的实用价值，缩短了大量样品的筛查时间，并避免了假阴性的发生。Pleadin等采用ELISA作为定量筛选方法测定猪组织中莱克多巴胺浓度。给猪连续口服饲喂莱克多巴胺28天，停药的1、3和8天后屠宰，测定肾脏、肝脏、肌肉、脑和心脏组织中莱克多巴胺的残留量。该方法的平均回收率在70%～90%之间，RSD小于13%。

2)胶体金免疫层析法(colloidal gold immunochromatographic assay，GICA)

GICA的基本原理是利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，然后用胶体金标记的抗体来进行直接显色。由于胶体金肉眼可见，故阴性反应者在膜上呈现红色斑点，阳性反应则不会形成红色斑点。张敏娟等1分别用GICA法和ELISA法对猪尿样品进行检测，两种方法阳性吻合率为85.71%，当生猪尿样中克伦特罗的浓度大于2700ppt时，吻合率达91.67%。该法仪器设备简单，试剂安全，对操作者没有太高的专业技术要求，能实现现场检测；缺点是反应线颜色受反应时间影响较大。

3)放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)

RIA法是利用同位素标记的抗原与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的放射性同位素体外微量分析方法。目前国外已有运用RIA测定克伦特罗的试剂盒产品。该法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、准确快速、易标准化等优点，但是由于所用仪器较昂贵，对条件要求较苛刻，并且放射性同位素对操作人员有一定的伤害，从而限制了广泛应用。Horne等采用RIA技术测定牛肝中克伦特罗的残留量，结合MSPD提取净化技术，使传统操作过程得到简化。该方法回收率在86%～96%之间。

4)荧光免疫分析法(fluoroimmunoassay，FIA)

FIA是利用三价稀土离子及其熬合物等荧光物质作为示踪物，代替同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、核酸探针等物质的一种免疫分析方法。当免疫反应发生后，根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析的目的。时瑾等采用时间分辨荧光免疫技术(TRFIA)，建立了猪尿中克伦特罗的间接竞争免疫分析方法。以克伦特罗-BSA为免疫原，制备抗体；克伦特罗与卵清蛋白(OVA)的联结物包被96孔板为固相抗原，与游离克伦特罗共同竞争有限的抗体，用稀土离子Eu3+标记的羊抗兔抗体进行示踪。该方法的灵敏度为0.01μg/L，测量范围为0.01～25μg/L，平均回收率为99.7%，RSD为3.9%；与盐酸异丙肾上腺素的交叉反应率为0.01%，与沙丁胺醇、盐酸肾上腺素、重酒石酸去甲肾上腺素无交又反应。8条不同时间进行的克伦特罗-TRFIA的效应点值ED80、ED50、ED20分别为(0.07±0.01)ug/L、(1.47±0.11)ug/L和(23.6±0.56)ugL。尿样经TRFIA和ELISA试剂盒同时检测克伦特罗，两者的相关系数为0.932，结果相符。该法具有灵敏度高、操作简便、示踪物稳定、定量分析量程宽、无放射性污染和应用范围广等优点，在疾病诊断、疗效观察等医学研究领域应用较多，但由于对温度的强烈依赖性和荧光强度取决于激发波长，因此在药物残留分析方面应用较少。