(4)生物传感器技术(biosensor)

其原理为待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生的复合物(或光、热等)通过信号转换器转变为可以输出的电信号、光信号等，从而达到分析检测的目的。利用生物传感器可检测动物尿液、血清中β-受体激动剂的含量。肖红玉等利用抗原抗体专一性结合而导致电化学变化的原理设计成了免疫生物传感器，克伦特罗的检出限为0.1ug/L，线性范围为0.1～8.1ug/L，检测时间在20min以内。通过对100个已知阳性样品和100个已知阴性样品的测试，准确率为97%

Chen等研制了以F0F1-ATP酶为动力蛋白的生物传感器，测定食品中的克伦特罗。标记F1300的内色素细胞荧光探针被用作检测由F0F1-ATP酶合成的ATP驱动的质子通量的pH指示剂。此外，F0F1 ATP酶的Flβ亚基附着在“抗抗体-生物素-抗生物素蛋白-生物素-第二抗体(特异性针对克伦特罗)”系统，作为生物传感器来检测克伦特罗残留。捕获机理是抗原-抗体反应，而检测基于旋转催化ATP合成过程中pH变化引起的荧光变化。结果表明，F0F1-ATP酶的活性受不同负载的影响，这种新的生物传感器可用于超痕量(10-12 g/L)克伦特罗的检测。该类方法具有灵敏度高、特异性强、样品前处理简单、检测迅速、携带方便、能重复利用并能实现现场检测和在线检测等优点。

(5)流动注射化学发光技术(flow injection-chemiluminescence，FI-CL)

Fl-CL的原理是基于把一定体积的液体试样注射到一个运动着的、无空气间隔的由适当液体组成的连续载流中。被注入的试样在向前运动过程中由于对流和扩散作用而分散成一个个具有浓度梯度的试样带，试样带与载流中某些组分发生化学反应，产生某种可以被检测的物质，然后被载带到检测器中连续记录其吸光度、电极电位或其他物理参数。试样流过检测器的流通池时，这些参数连续地发生变化。典型的检测仪输出信号呈峰形，其高度或面积与待测物浓度有关。陈丽莉等设计了一种快速检测猪肉中盐酸克伦特罗的Fl-CL免疫分析方法。由辣根过氧化物酶(HRP)催化的鲁米和过氧化氢-尿素加合物的化学发光反应，可通过4-联苯硼酸得到增强。在竞争性免疫反应后，上清酶标复合物由FI-CL法进行检测。在优化条件下，测定克伦特罗的线性范围为0.05～9ug/L(r=0.9959)，检出限为0.02μg/L。该方法已经成功应用于猪肉中克伦特罗残留的检测。

(6)色谱技术(chromatography)

色谱作为一种高效分离分析技术，是目前β-受体激动剂残留分析中应用最广的分析手段，主要包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)等。

1)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC是近年来发展较快的β-受体激动剂残留分析技术之一。采用高压泵、高效固定相和高灵敏度的检测器，具有重现性好、分离效率高等优点。结合紫外检测器(UVD)、二极管阵列检测器(DAD)、荧光检测器(FLD)、电化学检测器(ECD)等，对β-受体激动剂的检测限可以达到ug/kg级别。

Miyazaki等采用HPLC-UVD检测动物组织中克伦特罗，采用ODS柱分离，0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH3.5)-乙腈(7+3，v/v)为流动相，流速0.9mL/min，在209nm或242nm检测，测定低限为5ng/g，回收率为75.1%～86.4%。Tsai等采用HPLC-DAD检测猪血浆和组织中的克伦特罗和沙丁胺醇残留。Nova-pak C18色谱柱分离，沙丁胺醇流动相为乙腈-水(15+85，v/v)，克伦特罗流动相为乙腈-水(30+70，v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm(克伦特罗)和196nm(沙丁胺醇)。克伦特罗和沙丁胺醇的检测低限分别为0.2uL/L和0.1uL/L；血浆中沙丁胺醇的平均回收率为86.7%，克伦特罗为80.0%；肌肉中沙丁胺醇的平均回收率为64.2%，克伦特罗为62.9%。

Hashimoto等采用HPLC-FLD检测肉中的沙丁胺醇。在ODS柱(TSKgel-ODS80Ts)上分离，流动相为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH3.0)-乙腈(92+8，v/v)，激发波长为225nm，发射波长为310nm。方法测定低限为5ng/g，在100ppb添加水平的回收率为77.6%～81.5%。

安洪泽等采用反相HPLC-UVD-FLD法测定猪饲料中克伦特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、莱克多巴胺和班布特罗。在C18色谱柱上，以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流速1mL/min，UVD检测波长249nm(克伦特罗)，FLD激发波长226nm、发射波长306nm(沙丁胺醇、非诺特罗、莱克多巴胺和班布特罗)进行串联检测。方法检测限(LOD)为20ug/kg，LOQ为50ug/kg，平均回收率范围为86.7%～103.5%，CV范围为1.5%～9.5%。

一些β-受体激动剂具有电化学活性，可在电极上发生氧化反应，可采用ECD检测，来提高灵敏度。Turberg等采用HPLC-ECD检测了猪血清和猴血浆中莱克多巴胺残留。HPLC采用等度洗脱，电压为+700mV，运行时间6.5min。方法线性范围为0.5～40ng/mL，LOQ为2ng/mL。Zhang等采用HPLC-库仑电极检测系统对猪肝中的克伦特罗残留情况进行分析。四个电极串联使用，电位分别为450mV、600mV、650mV和680mV，从而避免了其他ECD检测中β-受体激动剂能在高电位作用下被不可逆的氧化的缺点，提高了HPLC的选择性和精密度。同时，研究了流动相pH对保留时间和峰高的影响和克伦特罗在石墨电极上的电化学行为。该方法线性良好，检测限为1.2ng/g。

2)气相色谱法(gas chromatography，GC)

GC与电子捕获检测器(ECD)、氮磷检测器(NPD)、氢火焰离子化检测器(FID)等结合，检测β-受体激动剂具有检测精密度高、分离度好，能分离其同位素、同分异构体、对映体等优点，但也具有样品需要衍生化，不能定性等缺点。

用GC测定β-受体激动剂通常需要衍生化来提高检测灵敏度，最常用的衍生化技术是硅烷化技术，常用的衍生化试剂是双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)。尽管有用环状二甲基硅烷吗啉(DMS)、甲基硼酸(MBA)等作为衍生化试剂的报道，由于其使用有一定的局限(如对特布它林无法生成衍生物)，而限制了使用范围。采用BSTFA进行衍生化反应如图1-2。

图1-2 β-受体激动剂与BSTFA的衍生化反应

崔晓明等建立了GC分析动物组织中盐酸克伦特罗残留量的方法。采用固相萃取分离富集动物组织中的盐酸克伦特罗，经BSTFA衍生化后用GC-ECD检测，以外标法多点校准定量。测得动物组织中克伦特罗的峰面积与样品浓度在0.005～1.0ug/mL范围内呈良好的线性关系，相关系数大于0.999，肉样的加标回收率在70%～80%，最低检出限为1ug/kg。谢维平等采用厚膜非极性柱对未经衍生化的克伦特罗直接分离，用NPD检测，分离峰形良好，平均回收率为86.0%，RSD为5.0%，相关系数为0.9993，线性范围为0.1～40.0mg/L，检测限为0.03mg/L。黄盈煜等提取内脏组织中的克伦特罗后，用乙酸酐衍生化，再采用GC-NPD检测。该方法线性范围为5～250ug/kg，最小检测浓度为0.011ug/mL。Engelmann等采用固相微萃取(SPME)提取净化样品中的克伦特罗，在进样口硅烷化衍生后，用GC-FID测定其六甲基二硅衍生物，检测灵敏度可以达到1.1ppb。

3)毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)

CE具有分离效率高、分析速度快、重现性好、样品和试剂用量少等优点，同时具有很大的操作灵活性，许多分离参数如缓冲液的组成、pH、毛细管的类型、所用电场的波形等都可以调节，分离效率可达几百万理论塔板数，被视为高效的分离技术之一。Gausepohl等利用CE-UVD来检测尿样中克伦特罗对映体的残留情况。样品用己烷-叔丁基甲基醚(99.5+0.5，v/v)提取后，电动注射进样(50s，10kV)，磷酸盐缓冲液(pH3.3)和羟乙基-β-环糊精作为手性选择剂。整个分析时间小于15min，以S-(-)-布拉洛尔为内标，克伦特罗对映体的检测限为0.5ng/mL。管月清等采用CE-ECD法测定了肉制品中克伦特罗和沙丁胺醇的含量。考察了缓冲液酸度和浓度、分离电压、氧化电位和进样时间等实验参数对分离检测的影响，在最佳实验条件下，工作电极为直径300um的碳圆盘电极，检测电位为+950mV(vs.SCE)，缓冲液为40mmol/L硼砂溶液(pH7.4)，分离电压18kV，在8min内即可实现二者的分离，且在两个数量级的范围内呈良好的线性关系，LOD分别为1.11×107mol/L和9.80×103mol/L，且抗坏血酸对其检测不产生干扰。