(2)免疫分析法(immunoassay, IA)
 
基于抗原与抗体特异性反应的免疫分析技术,一直是兽药残留快速检测和样品筛选方法的研究热点。CAPs的二氯酰胺醇和硝基苯结构与大分子蛋白结合后可作为完全抗原,并有效制备相应的抗体。从20世纪80年代后期开始,免疫法在众多的CAPs残留检测方法中发展迅速。免疫法主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、胶体金免疫层析法(GICT)、免疫传感器(IS)、荧光免疫分析法(FIA)等。其中,使用最普遍的是ELISA方法。
 
1)酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)
 
ELISA作为筛选方法,样品处理简单,样品通量大,检测成本低,不需复杂仪器设备,与一般仪器方法相比,检测限更低,且选择性高。因此,ELISA方法在现场监控和日常大批量检测工作中有着广阔的应用前景。
 
Campbell等于1984年率先报道了采用竞争ELISA方法检测CAP残留。采用市售的酶联抗兔免疫球蛋白抗体和添加底物,样品中游离的CAP和固定在固相上的CAP与特异性兔抗体竞争性结合,酶活性与样品中CAP的浓度成反比,用分光光度法测定。整个分析过程小于24h。该ELISA方法的定量范围在1~100ng/mL之间;对琥珀酸CAP和TAP具有交叉反应。何方洋等用重氮化方法将CAP与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原和包被抗原,ELISA鉴定。将偶联抗原用弗氏佐剂乳化后免疫兔子,制备多克隆抗体,硫酸铵沉淀法初步纯化,亲和层析法进一步纯化。建立竞争ELISA法检测CAP,方法LOD为0.3ng/mL。魏书林等利用活化酯法合成CAP抗原,作为免疫原免疫兔子得到CAP的单克隆抗体,建立了CAP间接竞争ELISA方法。结果显示抗体效价可达1:640000,半数抑制剂浓度(IC50)为1.3ng/mL,LOD达到0.05ng/mL,线性检测范围为0.1~36.45ng/mL,在0.5ng/g、1ng/g、2.5ng/g、5ng/g添加浓度水平,鸡肌肉组织中的回收率为55.4%~119%。
 
Tao等开发了一种竞争性的间接化学发光酶联免疫分析方法(CL-ELISA),检测牛奶和鸡肉中CAP残留。由于该多克隆抗体的独特特性,特殊反应系统和改进提取方法,优化条件后(吐温-20的浓度,PB的浓度和pH,温育时间和温度),方法LOD可达到0.92ng/L,定量范围在3.16~3035ng/L之间,IC50为17.29ng/L。牛奶和鸡肉中的回收率分别为104.9%~114.8%和101.0%~118.8%,CV为3.0%~14.6%和9.5%~14.4%。该作者又建立了一种高灵敏度的化学发光酶免疫测定方法(CLEIA)测定牛奶中的CAP。在优化条件下,在增强剂:3(10-吩噻嗪基)丙烷-1-磺酸盐(SPTZ)和4-吗啉(MORP)的存在下,通过辣根过氧化物酶(HRP-C)催化化学发光反应(ECR)。该HRP化学发光的LOD为0.33pg/孔。结果证明,这种新的增强剂可以显著提高HRP催化的ECR的光输出,提高检测灵敏度。Jiang等也开发了牛奶、奶粉、蜂蜜、鸡蛋和鸡肉中CAP的CL-ELISA方法。方法LOD为0.7ng/L,定量范围在2.1~92.4ng/L之间,IC50为13.6ng/L,灵敏度显著优于传统的ELISA方法。在5~60ng/L添加浓度,方法回收率为72.1%~116.0%,CV为4.2%~20.2%。
 
Wu等开发了间接竞争ELISA方法检测动物可食组织中的FFa。FFa通过戊二醛法共价连接到载体蛋白上作为免疫原,免疫获得多克隆抗体。该抗体的IC50为3.34μg/L。样品用乙酸乙酯-氢氧化铵(90+10,v/v)提取后,用该ELISA方法检测。猪肉、鸡肉和鱼的LOD分别为3.08ug/kg、3.3ug/kg和3.86ug/kg,回收率在64.6%~124.7%之间,CV为11.3%~25.8%。
 
部分已发表的CAPs的ELISA方法见表4-3。
 
表4-3 部分动物源产品中CAPs的ELISA检测方法