(2)免疫分析法(immunoassay， IA)

基于抗原与抗体特异性反应的免疫分析技术，一直是兽药残留快速检测和样品筛选方法的研究热点。CAPs的二氯酰胺醇和硝基苯结构与大分子蛋白结合后可作为完全抗原，并有效制备相应的抗体。从20世纪80年代后期开始，免疫法在众多的CAPs残留检测方法中发展迅速。免疫法主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、胶体金免疫层析法(GICT)、免疫传感器(IS)、荧光免疫分析法(FIA)等。其中，使用最普遍的是ELISA方法。

1)酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)

ELISA作为筛选方法，样品处理简单，样品通量大，检测成本低，不需复杂仪器设备，与一般仪器方法相比，检测限更低，且选择性高。因此，ELISA方法在现场监控和日常大批量检测工作中有着广阔的应用前景。

Campbell等于1984年率先报道了采用竞争ELISA方法检测CAP残留。采用市售的酶联抗兔免疫球蛋白抗体和添加底物，样品中游离的CAP和固定在固相上的CAP与特异性兔抗体竞争性结合，酶活性与样品中CAP的浓度成反比，用分光光度法测定。整个分析过程小于24h。该ELISA方法的定量范围在1～100ng/mL之间；对琥珀酸CAP和TAP具有交叉反应。何方洋等用重氮化方法将CAP与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联，制备免疫抗原和包被抗原，ELISA鉴定。将偶联抗原用弗氏佐剂乳化后免疫兔子，制备多克隆抗体，硫酸铵沉淀法初步纯化，亲和层析法进一步纯化。建立竞争ELISA法检测CAP，方法LOD为0.3ng/mL。魏书林等利用活化酯法合成CAP抗原，作为免疫原免疫兔子得到CAP的单克隆抗体，建立了CAP间接竞争ELISA方法。结果显示抗体效价可达1：640000，半数抑制剂浓度(IC50)为1.3ng/mL，LOD达到0.05ng/mL，线性检测范围为0.1～36.45ng/mL，在0.5ng/g、1ng/g、2.5ng/g、5ng/g添加浓度水平，鸡肌肉组织中的回收率为55.4%～119%。

Tao等开发了一种竞争性的间接化学发光酶联免疫分析方法(CL-ELISA)，检测牛奶和鸡肉中CAP残留。由于该多克隆抗体的独特特性，特殊反应系统和改进提取方法，优化条件后(吐温-20的浓度，PB的浓度和pH，温育时间和温度)，方法LOD可达到0.92ng/L，定量范围在3.16～3035ng/L之间，IC50为17.29ng/L。牛奶和鸡肉中的回收率分别为104.9%～114.8%和101.0%～118.8%，CV为3.0%～14.6%和9.5%～14.4%。该作者又建立了一种高灵敏度的化学发光酶免疫测定方法(CLEIA)测定牛奶中的CAP。在优化条件下，在增强剂：3(10-吩噻嗪基)丙烷-1-磺酸盐(SPTZ)和4-吗啉(MORP)的存在下，通过辣根过氧化物酶(HRP-C)催化化学发光反应(ECR)。该HRP化学发光的LOD为0.33pg/孔。结果证明，这种新的增强剂可以显著提高HRP催化的ECR的光输出，提高检测灵敏度。Jiang等也开发了牛奶、奶粉、蜂蜜、鸡蛋和鸡肉中CAP的CL-ELISA方法。方法LOD为0.7ng/L，定量范围在2.1～92.4ng/L之间，IC50为13.6ng/L，灵敏度显著优于传统的ELISA方法。在5～60ng/L添加浓度，方法回收率为72.1%～116.0%，CV为4.2%～20.2%。

Wu等开发了间接竞争ELISA方法检测动物可食组织中的FFa。FFa通过戊二醛法共价连接到载体蛋白上作为免疫原，免疫获得多克隆抗体。该抗体的IC50为3.34μg/L。样品用乙酸乙酯-氢氧化铵(90+10，v/v)提取后，用该ELISA方法检测。猪肉、鸡肉和鱼的LOD分别为3.08ug/kg、3.3ug/kg和3.86ug/kg，回收率在64.6%～124.7%之间，CV为11.3%～25.8%。

部分已发表的CAPs的ELISA方法见表4-3。

表4-3 部分动物源产品中CAPs的ELISA检测方法