4.1.4.2测定方法

CAPs残留分析的测定方法主要有微生物法、免疫分析法、薄层色谱法、毛细管电泳法、色谱及色质联用法等。基于抗原抗体特异性反应建立起来的免疫学测定方法具有灵敏度较高、特异性强、预处理简单、分析时间短等优点，目前已经研制出一些成熟的试剂盒产品，使用方便，有着广阔的应用前景色谱方法可检出样品中痕量的残留药物，具有检测限低、精确度高等特点：而色质谱联用技术更是目前唯一有效的确证手段，但是存在着操作复杂、时间长、成本较高的问题。

(1)微生物法(microbiological analysis， MA)

微生物法的主要原理是样品中如有抗生素残留，则会对培养基中的细菌产生抑菌圈，可以根据抑菌圈的有无及大小来判定结果。此种方法简便、费用低，但耗时长，敏感性和专一性低，易漏检，也会出现假阳性，引起误判，仅适用于对高残留量样品进行筛检。梅先芝等采用棉签法(STOP)测定鲤鱼肌肉组织残留的CAP，用棉签采集组织液后，置于枯草杆菌培养基中，保温过夜，观察抑菌圈有无及大小判断残留。该方法LOD为1.00u/g。焦彦朝等采用氯化三苯基四氮唑法(TTC)测定鲤鱼肌肉组织CAP残留，通过用TTC染色，量取抑菌圈直径，计算检测限及回收率。该方法平均回收率为51.3%～69.2%，LOD为0.25ug/g。

6)免疫PCR法(immuno polymerase chain reaction， IPCR)

IPCR是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。是用一段已知DNA分子标记抗体作为探针，用此探针与待测抗原反应，PCR扩增黏附在抗原抗体复合物上的这段DNA分子，电泳定性，根据特异性PCR产物的有无，来判断待测抗原是否存在。刘京在制备CAP全抗原的基础上，研制抗CAP单克隆抗体，利用抗CAP单克隆抗体建立IPCR分析法，检测牛奶中CAP的残留。以BSA、OVA为载体蛋白，采用EDC法制备CAP全抗原，免疫小鼠，制备抗CAP多克隆抗体。采用细胞融合和杂交瘤分选技术，经过筛选和亚克隆，成功获得能稳定分泌抗CAP单克隆抗体的细胞株1B7，接种于Balb/c小鼠腹腔，得到的小鼠腹水经纯化后效价为1：512000。以该抗体建立ELISA竞争抑制标准曲线，IC50和LOD分别为7.39ng/mL、0.24ng/mL，与CAPs的交叉率高达2052.8%，与其他药物未见明显交叉。当抗原包被浓度为10μg/mL，生物素酰化抗体的工作浓度为1：64000，亲和素工作浓度为10μg/mL，生物素标记的DNA投入量为10pg时，建立的IPCR方法LOD为1.380pg/mL，批内、批间CV均小于10%。用于牛奶样品中CAP检测时，回收率为86.8%～106.0%，RSD为4.94%～7.51%。

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