4.2.2.6测定

(1)液相色谱条件

色谱柱：Discovery C18色谱柱，5μm，150mm×2.1mm(内径)或相当者；柱温：40℃；流动相：甲醇+水(40+60，v/v)；流速：0.30mL/min；进样量：20μL。

(2)质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：-1750V；雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；辅助气温度：500℃；定性离子对、定量离子对、采集时间、去簇电压及碰撞能量见表4-7。

(3)定性测定

每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物和内标物的保留时间之比，也就是相对保留时间，与标准溶液中对应的相对保留时间偏差在±2.5%之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表1-5规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。

(4)定量测定

在仪器最佳工作条件下，对基质混合标准工作溶液进样，以标准溶液中被测组分峰面积和氘代氯霉素(d5-氯霉素)峰面积的比值为纵坐标，标准溶液中被测组分浓度与氘代氯霉素(d5-氯霉素)浓度的比值为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。内标法定量。

4.2.2.7 分析条件的选择

(1) 提取净化条件的选择

1)样品提取液的选择

甲砜霉素、氟苯尼考易溶于乙酸乙酯、乙腈。试验表明，采用碱化乙酸乙酯可提高甲砜霉素回收率，使上述两个化合物回收率都符合要求，因此本实验选用碱化乙酸乙酯作为提取溶剂。分别用乙酸乙酯-25%氨水(100+1)、乙酸乙酯-25%氨水(100+2)和乙酸乙酯-25%氨水(100+3)的碱性乙酸乙酯作为提取液，在同--添加水平，相同实验条件下，三者均能达到满意的回收率。但乙酸乙酯-25%氨水(100+3)的碱性乙酸乙酯的回收率实验更稳定。因此在本方法中选择含有乙酸乙酯-25%氨水(100+3)的碱性乙酸乙酯作为提取液。

2) 净化条件的选择

样品的乙酸乙酯萃取液中含有类脂物，需净化。通过实验以水-正己烷液液分配除脂，效果明显且回收率高。

3) 残渣溶解度实验

样品的乙酸乙酯萃取液浓缩后，残渣用水溶解。分别用1mL、2mL、3mL水溶解残渣，结果表明1mL、2mL、3mL水溶解残渣，氯霉素和氟苯尼考的回收率无明显差异，回收理想。而以3mL水溶解残渣，且超声5min，甲砜霉素的回收率最高。因此采用3mL水溶解残渣，且超声5min。

(2) 仪器条件的优化

1) 质谱条件的优化

蠕动泵以10uL/min的流速连续注射0.1mg/L的氯霉素类标准溶液入TurbolonSpray电离源中，在负离子检测方式下对三种氯霉素类进行一级质谱分析(Q1扫描)，得到分子离子峰，对各准分子离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子信息。由此确定定性用的各离子对。采用MRM模式采集数据，选择驻留时间为200ms，优化各离子对的去簇电压(DP)，碰撞气能量(CE)，聚焦电压(FP)，入口电压(EP)，碰撞池出口电压(CXP)。

2) 色谱条件的优化

采用“T”三通方式，即蠕动泵以10μuL/min的流速连续注射0.1mg/L的氯霉素类标准溶液，流动相则以300uL/min的流速与氯霉素类标准溶液混合后进入离子源来进行优化。当分别用0.1%甲酸、0.1%乙酸、1mmol/L醋酸铵溶液代替流动相组成中的水，未发现氯霉素灵敏度的明显变化。实验以乙腈-水(30+70，v/v)作为流动相，未观察到CAP灵敏度的显著提高。以甲醇-水(40+60，v/v)作为流动相，灵敏度足以满足要求。

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