(6)液相色谱-质谱联用法(liquid chromatography-massspectrometry，LC-MS)

LC-MS是目前残留分析中最重要的分离分析方法之一。作为-种高灵敏度和高选择性的检测技术，可用于目标化合物确证。并随着仪器不断改进，其检出限也越来越低，提供的碎片信息更可靠，广泛应用于食品安全残留检测。而液相色谱-四极杆串联质谱技术(LC-MS/MS)目前已成为β-内酰胺药物残留确证分析最常用的手段。

1)液相色谱-单极质谱法(LC-MS)

Blanchflower等使用LC-ESI-MS测定了肌肉、肾、牛奶中的青霉素G、青霉素V、苯唑青霉素、邻氯青霉素和双氯青霉素。使用萘夫西林做内标，药物经IntersilODS-2色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)分离，流速为150μL/min，流动相为乙腈-水-三乙胺(27+73+0.5，v/v)和乙腈-水-三乙胺(23+77+0.5，v/v)，流速为0.5mL/min，ESI电离，正离子检测。药物在200ng/g添加浓度下，平均回收率为87.5%～110%，RSD为1.1%～7.3%。Msagati等用LC-ESI-MS检测牛奶、肉、肾脏中的阿莫西林、氯唑西林、青霉素V和青霉素G。流动相为水-甲醇(含25mmoL/L乙酸，75+25，v/v)，流速为0.15mL/min，进样体积20μL，色谱柱为C18 Higgins Clipeus(150mm×3mm，5um)，MS在正离子下进行监测。该方法测得肾脏和肝脏中青霉素G和青霉素V的LOD为1ng/kg，牛奶为0.7ug/L；肾脏和肝脏中氨苄西林的LOD为1.4μg/kg，牛奶为1.7ug/L；肾脏和肝脏中青霉素G的LOQ分别为1.1ug/kg、0.01μg/kg，青霉素V的LOQ分别为0.4ug/kg、0.01μg/kg。
Keever等检测牛奶中头孢噻呋，样品超速离心后LC-ESI-MS检测。经Nova pak C18色谱柱进行分离，流动相为水和乙腈(含有1%乙酸和25mmoL/L七氟丁酸酐)，流速为1mL/min；采用ESI电离源，正离子扫描检测。牛奶中头孢噻呋的LOD为10ppb，LOQ为25ppb。

Holstege等测定了牛奶中氨苄西林、阿莫西林、青霉素G、青霉素V、氯唑西林、头孢匹林和头孢噻呋，用乙腈提取，OasisHLB柱净化，LC-MS检测。1%乙酸水-甲醇做流动相，Luna C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)进行梯度洗脱，流速为0.5mL/min，采用ESI正离子模式电离。该访法测得7种药物的LOQ为0.2～2μg/mL。Tyczkowska等用LC-ESI-MS检测牛奶中β-内酰胺类抗生素。用乙腈-甲醇-水(2+1+1，v/v)与牛奶混合，离心后直接进样。样品LC-UVD分析采用18%乙腈溶液(含0.25%磷酸、0.25mmoL/L辛烷溶液中含0.3%三乙胺、4.75mmoL/L十二烷基溶液)作为流动相，等度洗脱，苯基柱(250mm×4.6mm，3μm)分离，流速为1mL/min，紫外检测波长为200～350nm。接着该研究采用LC-ESI-MS验证LC-UVD检测的准确性，流动相为乙腈、1%乙酸溶液(pH3.0)(40+60，v/v)，等度洗脱，流速为0.3mL/min，ESI电离，选择离子模式(SIM)检测。与LC-UVD相比，LC-ESI-MS提高了灵敏度，改善了选择性，方法LOD为0.1mg/L。Bruno等检测牛奶中10种β-内酰胺药物，采用SPE提取净化，LC-MS检测。经C18反相色谱柱(250mm×4.6mm，5um)进行分离，流动相为甲醇和水，梯度洗脱，流速为1mL/min；ESI电离源，碰撞诱导解离，正离子模式电离。该方法测得β-内酰胺类药物的回收率在70%～108%之间，RSD为5%～11%，LOQ为0.4～3ng/mL。

Voyksner等用ESI接口，源内碰撞解离(CID)技术，对PENs裂解机理做了探讨。研究发现，在ESI正离子、CID电压为160V时，得到质子化分子离子[M+H]+强度较高，β-内酰胺环开环后，得到共有特征离子[C6H9HSO2+H]+，m/z160；进一步脱COOH，得到[C6H9HSO2+H-COOH]+，m/z114；酰胺部分裂解，产生化合物的特征离子。采用ESI负离子时，得到准分子离子[M-H]-，CID碰撞后，β-内酰胺环开环，脱去中性分子CO2和H2O，形成[M-H-CO2]-和[M-H-H2O]-，但离子强度较正离子电离弱。

2)液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)

黄百芬等建立一种用LC-MS/MS快速测定牛奶中6种PENs残留的方法。分析物经色谱柱Waters Atlantis ODS C18柱(150mm×2.1mm，5μm)进行分离，用0.1%甲酸和乙腈作为流动相，梯度洗脱，流速1mL/min，ESI电离源，正离子模式监测。在26min内，6种PENs得以分离；6种PENs的LOD为0.02～0.19ng/mL；在0.2～2.0ng/mL线性范围内，相关系数为0.991，回收率大于90%，方法精密度为4.87%。Riediker等报道了LC-ESI-MS/MS检测牛奶中阿莫西林、氨苄青霉素、氯唑青霉素、苯唑西林和青霉素G的方法。采用YMCODS-AQ色谱柱(50mm×2mm，3um)进行分离，流动相为0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸-乙腈(35+75，v/v)，流速为0.5mL/min；正离子模式下进行ESI电离，多反应监测模式(MRM)检测。该方法回收率在76%～94%之间，LOQ为0.40～1.10μg/kg。Bogialli等用LC-MSMS检测牛肉、肝脏、肾脏和牛奶中两种两性青霉素(阿莫西林和氨苄西林)。采用Altima C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)进行分离，甲醇-水(均含有10mmol/L甲酸)作为流动相，梯度洗脱，流速为0.15mL/min，ESI正离子电离，SRM模式进行检测。该方法测得阿莫西林和氨苄西林的LOQ小于1ppb，回收率为74%～95%，RSD小于9%。Xi等开发了一种LC-MS/MS同时测定和确认狗血浆中阿莫西林和克拉维酸。血浆样品采用简单乙腈脱蛋白，然后将上清液直接用水稀释。在Phenomenex Luna C8反相柱_上分离，用0.1%甲酸和乙腈梯度洗脱，流速为0.25mL/min，ESI负离子源，MRM模式进行检测。阿莫西林和克拉维酸在0.5～500ng/mL范围内线性良好；阿莫西林和克拉维酸的CCa分别为0.06ng/mL和0.08ng/mL，CCβ均低于0.5ng/mL；在标准曲线范围内获得了可接受的精密度和准确度；在三个添加水平下(0.5ng/mL、50ng/mL和500ng/mL)，阿莫西林和克拉维酸回收率分别为102%和115%，RSD小于15%。

Feng等提出了--种快速、灵敏的确认牛肾脏中头孢噻呋代谢产物(DCCD)的方法。利用磷酸盐缓冲液提取，固相萃取净化，超高效液相色谱(UPLC)-MS/MS检测，氘代内标定量。该方法以0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸乙腈溶液为流动相，Phenomenex Kinetex C18柱(50mm×2.1mm，2.6um)进行分离，梯度洗脱，流速为0.3mL/min，柱温为30℃。采用ESI电离源，正离子监测，毛细管电压为2.5kV。基质校准曲线线性范围为25～2000ng/g；添加浓度为50～1000ng/g时，回收率为97.7%～100.2%，CV小于等于10.1%；确认限为50ng/g。白国涛等采用UPLC-MS/MS测定了牛肉中9种CEPs残留量的方法。以乙腈-水(含0.05%甲酸)为流动相，Acquity UPLC BEH C18柱(50mm×2.1mm，1.7um)进行梯度洗脱，流速0.3mL/min，柱温30℃。头孢呋辛采用负离子检测，其他8种CEPs均采用ESI正离子、MRM模式检测。9种CEPs在5min内达到分离；头孢呋辛的LOQ为10μg/kg，头孢洛宁和头孢噻呋的LOQ为0.5μg/kg，其他CEPs的LOQ均为1.0μg/kg；加标回收率为74.2%～119%，精密度小于等于15%。

Ghidini等用10%乙酸提取牛奶中7种β-内酰胺类药物(青霉素G、氨苄西林、苯唑西林、阿莫西林、双氯西林、头孢氨苄、头孢匹林)，离心过膜后，LC-MS/MS检测。采用反相色谱柱Merck-LiChrospher 100 RP 18(250mm×4mm，5μm)进行分离，流动相为0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，流速为1mL/min，ESI电离源，正离子扫描。该方法测得7种药物的回收率在28%～82%之间，LOD为1～5μg/L。Fagerquist等用LC-ESI-离子阱质谱(MSn)检测肾脏中阿莫西林、头孢菌素、头孢唑林、青霉素G等11种β-内酰胺类药物。采用色谱柱YMCODS-AQ(50mm×4.6mm，3um)进行分离，0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈作为流动相，梯度洗脱，流速为0.3mL/min；采用ESI电离源，正离子检测，金属毛细管温度为230℃。该方法测得11种β-内酰胺类药物的LOD为10～100ng/g。Heller等使用LC-ESI-MSn方法测定了牛奶中7种β-内酰胺类抗生素残留。采用0.1%甲酸水-甲醇(9+1，v/v)和甲醇作为流动相，YMC反相色谱柱(150mm×2mm，5.0μm)进行分离，梯度洗脱，流速0.3mL/min，ESI电离源，正离子扫描。可以检测到牛奶中苄青霉素的LOD为5μg/L，氨苄西林、羟氨苄青霉素、邻氯青霉素、头孢匹林、头孢噻呋、头孢唑啉的LOD为10μg/L。

动物源基质中β-内酰胺类药物的部分LC分析方法见表5-4。

表5-4 动物源基质中β-内酰胺类药物的部分LC分析方法