(5)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)

20世纪90年代以后，HPLC成为β-内酰胺类药物残留检测中应用最广泛的方法。由于β-内酰胺类药物在结构上都含有羧酸基团，早期采用离子交换色谱(一般选用阴离子交换柱)来分离测定。对于两性离子型化合物，在流动相中添加离子对试剂来调节容量因子，改善分离效果，即侧链含酸性基团的加酸抑制剂并加碱性反离子；侧链含碱性基团的，加有机胺类化合物或选择含胺的缓冲溶液，或选择低pH的乙酸缓冲溶液。但因所用流动相的pH往往低于β-内酰胺类药物稳定的最佳pH而造成检测效果不甚理想，近几年已改用反相色谱法分析。常用的检测器主要是浓度型的紫外检测器(ultraviolet detector，UVD)荧光检测器(fluorescence detector，FLD)和电化学检测器(electrochemical detector，ECD)。

1) UVD检测

刘媛等报道了动物组织中阿莫西林的残留检测方法。样品用三氯乙酸沉淀蛋白，固相萃取净化和富集，经1，2，4-三唑-氯化汞衍生化后，采用nertsil ODS-3(250mm×4.6mm，5um)分离，以0.5moL/L磷酸盐缓冲液-乙腈(80+20，v/v)为流动相，流速为1.0mL/min，在323nm波长处检测，建立了反相HPLC分析鸡肉、猪肉、猪皮、猪脂肪等动物组织样品中阿莫西林残留量的方法。该方法线性范围为8.6～860μg/L；采用外标法定量，加标回收率为70.9%～86.8%，RSD为3.2%～16.4%；LOD低于10μg/kg。Boison等建立了1，2，4-三唑-氯化汞柱前衍生，测定动物组织中苄青霉素的，HPLC方法。青霉素V和苄青霉素经60%乙腈-35%水-5% 0.2moL/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，紫外最大吸收波长为325nm，较大的波长减少了干扰组分。该方法测得肝脏、肾脏和肌肉组织中青霉素G的LOD为5μg/kg。Terada等利用HPLC-UVD测定牛奶中青霉素G、青霉素V和氨苄青霉素残留量。采用甲醇-水-0.2moL/L磷酸盐缓冲液(pH4.0)(5+13+2，v/v，含11mmoL/L 1-庚烷磺酸钠)作为流动相，LiChrosorb RP-18色谱柱分离，检测波长为210nm。牛奶中青霉素G、青霉素V和氨苄青霉素在添加浓度0.5ug/g、0.1ug/g的回收率均大于87%，RSD为1.17%～4.98%，LOD为0.03ug/g。Beconi-Barker等建立了猪组织中头孢噻呋及其代谢物残留量的检测方法。采用赤藻糖醇盐缓冲液提取，碘代乙酰胺柱前衍生，HPLC-UVD检测。经BDSHypersil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5um)分离，流速为1.0mL/min，紫外检测波长为266nm。方法回收率在70%～95%之间，LOD为100μg/kg。赵军等以乙酸-乙酸钠缓冲液(pH3.6)-甲醇(75+25，v/v)为流动相，采用Dupout C8 色谱柱(300mm×4.6mm)分离，254nm紫外检测，测定了血清中的头孢拉定、头孢氨苄、头孢克洛、氨苄青霉素和阿莫西林。LOD可分别达到0.18ug/mL、0.21ug/mL、0.12ug/mL、0.35ug/mL和0.25ug/mL；血清回收率均大于94.6%。

2)FLD检测

罗道栩等测定了牛奶中氨苄青霉素，在酸性条件下提取液中的氨苄青霉素与甲醛加热生成2-羟基-3-苯基-6-甲基吡嗪(氨苄青霉素荧光衍生物)，以磷酸盐缓冲液-乙腈(75+25，v/v)为流动相，采用Supelco Discovery C8 柱(250mm×4.6mm，5um)分离，FLD检测，激发波长为346nm，发射波长为422nm。方法LOD为1μg/L，LOQ为2μg/L，回收率为70%～110%，批内CV在10%以内，批间CV小于15%。Ang等采用HPLC-FLD检测鲶鱼和鲑鱼组织中阿莫西林残留。样品先用磷酸缓冲液(pH4.5)提取，然后用三氯乙酸溶液沉淀鯰鱼和鲑鱼中的蛋白质，C18固相萃取柱净化后，LLP除去非极性干扰物。提取液与甲醇和三氯乙酸在100℃反应30min，荧光衍生物经醚提取，浓缩，HPLC-FLD检测。鯰鱼组织中阿莫西林在2.5～20ppb添加浓度范围内平均回收率大于80%，鲑鱼组织中阿莫西林平均回收率大于75%，CV小于6%；鲶鱼组织中阿莫西林的LOD和LOQ分别为0.5ppb、1.2ppb；鮭鱼组织中LOD和LOQ分别为0.8ppb、2.0ppb。但是这种方法对于没有氨基的PENs不适用。

Meng等建立了一种检测人血浆中头孢氨苄的HPLC-FLD方法。头孢氨苄在5mmoL/L硼酸盐溶液(pH8.5)中经芴甲氧羰酰氯(FMOC-CI)进行衍生化，25℃反应15min，衍生化产物经XDB-C18色谱柱分离，流动相为水-乙腈(10+90，v/v)，等度洗脱，流速为1.0mL/min，激发波长和发射波长分别为268nm、314nm。该方法测得血浆中头孢氨苄LOD为0.014ug/mL，线性范围为0.0234～58.5ug/mL。Blanchin等建立了检测血浆中头孢克洛、头孢氨苄、头孢拉定、头孢沙定、头孢甘酸和头孢羟氨苄的HPLC-FLD方法。采用荧光胺柱后衍生化，衍生化系统为4.5m×0.25mmi.d.的PTPE毛细管线圈，衍生剂流速为0.25mL/min，在室温下反应，驻留时间为10.6S。血浆中的回收率为88.7%～105.6%，6种CEPs的LOD为0.3～1.8mg/L。

3)ECD检测

ECD是根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测的。在液相色谱中对那些没有紫外吸收或不能发出荧光但具有电活性的物质，可采用电化学检测法。若在分离柱后采用衍生技术，还可将它扩展到非电活性物质的检测。Lihl等采用HPLC-光化学降解-ECD检测牛肌肉组织中青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林和双氯西林。分析物经LiChroCART色谱柱(250mm×4mm，5μm)分离，流动相为乙腈-0.2moL/L磷酸盐缓冲液(pH3.0)(35+65，v/v，含2mmoL/L Na2EDTA)，等度洗脱；ECD电压为+0.65V(vs.Ag-AgCl)，该方法测得PENs的平均回收率为60%～103%，CV为6%～11%，相比225nm波长处检测PENs，灵敏度提高了5倍。

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