6.1.4.2 测定方法

MALs种类较多，结构相似，对于该类药物的安全使用和残留检测一直是各国关注的焦点和研究的重点。而林可胺类药物常常与MALs同时使用，因此需要进行多残留同时分析。目前，国内外关于MALs和林可胺类药物残留分析的文献较多，其检测方法主要包括微生物法、免疫分析法(IA)、薄层色谱法(TLC)、毛细管电泳法(CE)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用法(GC-MS)和液质联用法(LC-MS)等。总体说来，大多仪器分析技术基本都可用于两类药物的残留检测，以HPLC和LC-MS最为常见。随着残留分析技术的发展，CE和TLC由于灵敏度达不到要求而逐渐被色质联用法所代替。

(1)微生物法(microbiologicalanalysis)

微生物法是经典的MALs含量测定方法。王敏等利用微生物生长抑制的原理，对6种MALs残留进行了定性检测。该方法通过MALs敏感菌Bacillusstearothermophilus细菌的生长与否，来判断MALs的存在。该方法对多种基质的动物源食品检测限低，能够达到食品中MALs的MRL的1/2，操作简单且不需要复杂的仪器设备，可作为有效的筛选方法。Nouws等建立了微生物法测定牛奶中MALs等多种类药物的残留量。该方法以枯草杆菌、藤黄微球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌等作为试验用菌株，通过平板上抑制区域的大小来判断药物残留量的多少，除了少数几种药物，大多数待测抗生素的灵敏度都能满足欧盟所规定的牛奶中抗生素MRLs的要求，待测的48种抗生素均未超过欧盟所规定的MPLs。在规定MRLs水平上，7种培养板的平均CV为4.5%～9.8%。黄晓蓉等利用微生物抑制法检测了肉类、水产品及蛋中的MALs残留量，方法的LOD值为0.05mg/kg。采用藤黄微球菌ATCC9341、枯草芽胞杆菌ATCC663、蜡样芽孢杆菌蕈状变种ATCCI1778为敏感菌，一次操作可同时检测肉类、水产品及蛋中的四大类抗生素残留。微生物法作为筛选方法具有简便、快速、易操作等优点，但由于固有的局限性，结果可比性差，方法灵敏度不佳，达不到准确定性定量分析的目的，逐渐被仪器分析方法所取代。

(2)薄层色谱法(thinlayerchromatography，TLC)

TLC法用薄层板将样品提取液中被测物展开分离后，测定样品与标准样品吸收光变化或采用发射光薄层扫描法来测定被测物含量。Ramirez等引采用了高效薄层色谱(HPTLC)-生物自显影方法进行牛奶中红霉素等药物的多残留检测。该方法采用枯草杆菌作为检测目标微生物，残留的抗生素用乙腈进行提取，石油醚进行除脂后，用二氯甲烷进行分离。该方法完全满足牛奶中残留限量的要求，平均回收率达90%～100%，CV为7.2%～21.3%。这种高效薄层色谱分析大大地缩短了分析时间，并有效地改善了红霉素等药物的敏感性。韩南银等建立TLC法来检查蜂蜜中残留的红霉素。以固相萃取对红霉素进行了提取，极性的硅胶作固定相，乙酸乙酯～乙醇-15%醋酸铵混合液(86+38+76，v/v)为展开剂，浓硫酸-香草醛-95%乙醇混合(4+0.33+36，v/v)作为显色剂，其LOD可达5mg/kg。

(3)毛细管电泳法(capillaryelectrophoresis，CE)

作为分离技术中的一种，CE有较高的分离效率，可同时分析多种待测成分，且所需时间较少，并能准确定量。但是，也存在一些缺点，比如对于上样量较少的样品来说，往往灵敏度不够。此种方法用于MALs和林可胺类药物残留分析的报道较少。李向丽等基于泰乐菌素能增强联吡啶钌[Ru(bpy)32+]电化学发光信号的现象，结合CE分离技术，建立了动物组织和蜂蜜中泰乐菌素测定的新方法。实验分别对检测和分离条件进行了优化，在优化条件下，泰乐菌素在浓度0.05～10.00μg/mL范围内具有良好的线性关系，LOD为0.02ug/mL，用于实际样品中泰乐菌素的测定，回收率为80.0%～95.0%。

(4)气相色谱法(gaschromatography，GC)

MALs和林可胺类药物的分子量均较大，而且结构中含有较多的极性基团，直接采用GC分析是不行的，必须经过衍生化后才可以进行GC分析。

Luo等建立了鲑鱼组织中林可霉素的GC检测方法。采取磷酸缓冲液提取鲑鱼组织中的林可霉素，经C18固相萃取净化后，用N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺作衍生化试剂进行衍生，形成一个三甲基硅烷基，再进行GC分析，氮磷检测器(nitrogen-phosphorusdetector，NPD)检测。该方法在25～250ng/g浓度范围内线性较好，相关系数r为0.994；在50ng/g、100ng/g、200ng/g三个添加浓度水平上，平均回收率均大于80%，RSD均小于6%；LOD为1.7ppb，LOQ为3.8ppb。陶燕飞等建立了动物可食性组织中林可霉素和大观霉素残留量的GC测定方法。提取物中加入500μL硅烷化试剂(BSTFA)和100μL乙腈，涡旋混合1min，密封，75℃恒温箱中衍生化反应1h后，GC分离后NPD测定。该衍生化产物较为稳定，密封情况下至少一周不会降解，但应避免置于潮湿环境中。林可霉素的LOQ为30μg/kg，在30～3000ug/kg添加水平，回收率为73.2%～85.7%。该作者还应用GC-NPD和气相色谱-质谱(GC-MS)建立了一种定性、定量测定动物性食品中林可霉素和大观霉素残留的多维分析方法。该方法采用磷酸盐缓冲进行液加速溶剂萃取(ASE)，三氣乙酸脱蛋白，加入十二烷磺酸钠作为离子对试剂进行C18固相萃取净化，洗脱液吹干后用BSTFA衍生化，进行GC-NPD分析和GC-MS确认。这两种药物在GC-NPD方法中的LOQ分别为16.4μg/kg和21.4μg/kg，在GC-MS方法中的LOQ分别为4.1μg/kg和5.6μg/kg；添加水平为20～200μg/kg时，GC-NPD方法的回收率为73%～99%，RSD小于17%；添加水平为5～20μg/kg时，GC-MS方法的回收率为70%～93%，RSD小于21%。Takasuki等建立了组织中ERM、OLE、SPI、KIT、TYL的气相色谱-质谱(GC-MS)分析方法。肉样经甲醇提取、LLP后，再使用硅胶固相萃取柱净化以除去干扰物质。提取物在铂的催化下加氢，打开碳碳双键结构，并在0.3mol/L盐酸中水解脱去中性糖链，水解产物在醋酸酐-吡啶中酰化生成醋酸酯。衍生化的目的在于降低待测物的分子量和极性，而使用醋酸酐酰化较硅烷化得到的衍生物分子量更小，可提高质谱检测的灵敏度。

百检网就是一家权威的食品检测机构，提供各种检测需求服务，有任何疑问欢迎电联或者在线咨询客服。