19.1.4 残留分析技术

19.1.4.1 样品处理方法

硫脲嘧啶类药物由硫脲嘧啶和巯基咪唑衍生而来，均为极性杂环两性化合物，分子量小，提取、净化和分析都是挑战。首先，要从生物基质中把它的互变异构体提取出来；其次，要利用合理净化手段，有效去除生物基质中的干扰杂质；再次，要改善分子结构，降低化学极性，增强检测特异性和灵敏度。

(1) 提取方法

硫脲嘧啶类药物极性较强，动物基质中残留的硫脲嘧啶类药物可以采用乙酸乙酯、甲醇、乙腈和二氯甲烷等多种有机溶剂提取，而乙酸乙酯是采用最多的有机试剂。

Buick等用乙酸乙酯直接提取牛甲状腺和血清中的甲巯咪唑、硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、丙基硫脲嘧啶、苯基硫脲嘧啶。提取甲状腺时，加入0.1mol/L EDTA；提取血清时，加入15μL巯基乙醇。高效液相色谱(HPLC)测定，甲状腺中5种药物的回收率在18.0%～75.4%之间，日间变异系数(CV)不超过25.88%，检测灵敏度为2.45～4.52ng/g；血清中5种药物的回收率在40.0%～92.6%之间，日间CV不超过26.67%，检测灵敏度为16.98～35.25ng/mL。Blanchflower等开发了甲状腺中的甲巯咪唑、硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、丙基硫脲嘧啶、苯基硫脲嘧啶的液相色谱-质谱(LC-MS)检测方法。3g样品中加入50μL 0.1mol/L EDTA、15uL巯基乙醇和1g无水硫酸钠，再加入10mL乙酸乙酯均质提取。该方法添加回收率在48.1%～95.8%之间，检测灵敏度在25ng/g左右。我国国家标准GB/T20742-2006规定 了牛甲状腺和牛肉中硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、正丙基硫脲嘧啶、它巴唑、巯基苯并咪唑残留量的液相色谱.串联质谱(LC-MS/MS) 测定方法。采用10mL乙酸乙酯、3g无水硫酸钠、20μL巯基乙醇和30μL 0.1mol/LEDTA提取。该方法回收率在82.8%～92.9%之间，CV在5.23%～9.48%之间，定量限(LOQ)均为2μg/kg。GB/T21310- 2007也采用了类似的提取方法，规定了动物源性食品中硫脲嘧啶、甲巯咪唑、甲基硫氧嘧啶、丙硫氧嘧啶、苯基硫氧嘧啶和2-巯基苯并咪唑等6种甲状腺拮抗剂残留量的LC-MSMS检测方法。研究发现，用乙酸乙酯提取时，加入EDTA、巯基乙醇可以破除蛋白结合，提高硫脲嘧啶类药物的回收率，而无水硫酸钠盐析作用可使极性化合物由水相转入有机溶液；同时，超声波水浴在提取中的广泛使用，可以保证样品中的硫脲嘧啶类药物被充分提出。

Zakrzewski等报道了测定血清中3种硫脲嘧啶类药物的薄层色谱(TLC)方法。采用甲醇稀释、提取后TLC测定，检测灵敏度在0.75～2.5nmoL/mL之间。Pinel等采用甲醇在超声波水浴中提取冻干组织(肌肉、肝脏和甲状腺)中的8种硫脲嘧啶类药物，经净化后用LC-MS/MS测定。该方法检测限(CCa)为0.1～5.2μg/L，检测能力(CCβ)为2.6～23.2μg/L，满足欧盟100μg/L的临时最低要求的性能极限(the provisional minimum required performance limit，MRPL) 要求。De Wasch等采用甲醇提取甲状腺中的巯基苯并咪唑、硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、丙基硫脲嘧啶、苯基硫脲嘧啶和甲巯咪唑，经固相萃取净化和衍生化后，用LC-MS测定。6种药物的CCβ均为20μg/kg。

Yu等采用乙腈提取牛肉中的硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、丙基硫脲嘧啶、苯基硫脲嘧啶，经净化和衍生化后用气相色谱-质谱(GC-MS)测定。该方法回收率在50%～90%之间，CV小于10%；硫脲嘧啶的LOQ为25μg/kg，其他药物为15μg/kg。Liu等采用乙腈提取动物组织中的巯基苯并咪唑、硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、丙基硫脲嘧啶和苯基硫脲嘧啶，并对乙酸乙酯、乙腈、丙酮、氯仿、甲醇的提取效率进行了比较。结果表明，采用乙腈提取三次后回收率近100%，并且乙腈还可以有效沉淀动物蛋白。

研究发现，硫脲嘧啶类药物在生物基质中处于互变异构的平衡转化中(图19-2)。酸性基团巯基、羟基，碱性基团叔胺基的存在，也可以采用碱性或酸性溶剂提取。

图19-2 TUs互变异构示意图
1为主要的互变异构体

Wei等用10% HCl将血清样品调至pH6，再加入二氯甲烷提取样品中的甲基硫脲嘧啶和丙基硫脲嘧啶，HPLC测定。该方法的检出限(LOD)为0.03μg/mL，LOQ为0.1μg/mL；回收率在90%～110%之间，相对标准偏差(RSD)小于5%。Perez-Ruiz等采用甲醇-1mol/L氢氧化钠(80+20，v/v)提取饲料和尿液中的硫脲嘧啶和苯基硫脲嘧啶，经衍生化后，用毛细管电泳(CE)测定。方法回收率在75%～92%之间，RSD小于3%。Le Bizec等建立了甲状腺中6种硫脲嘧啶类药物的GC-MS检测方法。采用0.1mol/L氢氧化钠直接提取，经衍生化和净化后测定，方法回收率在40%～70%之间，灵敏度可以达到ng/g水平。

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