9.1.4 残留分析技术

9.1.4.1 前处理方法

生物样品中的非甾类同化激素类药物常与葡糖苷酸、硫酸形成轭合物，这些轭合物极性和水溶性较高、热稳定性差，与原形药物性质差异大，前处理中容易损失，需要将其水解后再处理。文献报道的主要有酶水解和酸水解方法。

(1)水解方法

1)酶水解

非甾类同化激素类药物的酶水解常使用芳基硫酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶及其混合物。

Yang等利用酶水解提取肌肉(猪肉、牛肉和虾)、牛奶和肝脏中的50种同化激素类药物(包括DIS、HES和DES)。在5g样品中加入10mL乙酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH5.2)，再加入100μL葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶，37℃过夜，甲醇提取，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测。方法的定量限(LOQ)为0.04～2.0μg/kg，平均回收率为76.9%～121.3%，变异系数(CV)为2.4%～21.2%。许泓等利用酶水解提取动物源性食品中DES、HES和DIS残留。5.0g样品，用叔丁基甲基醚提取，在40℃水浴氮吹仪中吹去残余叔丁基甲基醚后，加入80uL β-葡糖苷酸酶，于52℃烘箱中放置过夜，为保证酶解效率须将叔丁基甲基醚除净。提取液硅胶柱净化，LC-MS/MS测定。方法对DES、DIS的检出限(LOD)为0.05ng/g，在0.5～10ng/g范围内回收率为84%～108%，
对HES的LOD为0.025ng/g，在0.25～5ng/g范围内回收率为59%～87%。

彭涛等利用酶水解提取动物肝脏中的RALs(TAL、a-ZOL、β-ZOL、ZER、ZAN、ZON)。在约5.0g均质后的动物肝脏样品中加入10mL乙酸钠缓冲溶液(0.05mol/L)和0.025mL β-葡萄糖苷酸/硫酸酯复合酶，旋涡混匀，于37℃水浴中振荡水解12h，乙醚提取，HLB固相萃取柱净化，LC-MS/MS检测。在添加浓度1～4μg/kg范围内，方法回收率在70%～90%之间，相对标准偏差(RSD)小于20%；6种RALs的判断限(CCa)在0.17～0.31μg/kg之间，检测能力(CCβ)在0.26～0.42μg/kg之间。曹莹等利用酶水解提取鸡肝脏中ZER残留。取5.0g鸡肝匀浆于50mL离心管中，加入5mL 50mmol/L的乙酸钠缓冲液，加入25μL β-葡萄糖苷酸酶，旋涡混匀，于37℃培养箱中酶解12h，乙醚提取，液相色谱-质谱(LC-MS)分析，方法的LOQ为4ng/g，回收率为65.0%～86.4%，CV为5.1%～15.4%。

Kathrin等利用酶水解方法提取牛尿液中二苯乙烯类化合物(DES、DIS、HES)与RALs(ZER、TAL、a-ZOL、β-ZOL和ZON)。5mL尿液样品中加入2mL乙酸钠缓冲液(2mol/L，pH5.2)，加入100μL蜗牛液(Helix pomatia juice)，37℃避光放置16h或50℃放置3h，水解完成后氢氧化钠溶液(2mol/L)调pH9.0±0.1，5mL乙醚提取2次，固相萃取柱净化，LC-MSMS分析。方法检测二苯乙烯类化合物和RALs的LOD分别低于1μg/L和1.5ug/L，回收率分别为99.2%～106.0%和99.4%～107.9%。

2) 酸水解

文献也有报道非甾类同化激素类药物常与脂蛋白类结合，所以用酸水解可以提高回收率。Barkatina等认为与酶水解相比较，酸水解更有利于提高回收率，因为食物中的非甾类同化激素类药物主要与脂蛋白类广泛结合，与葡糖醛酸的结合物较少。将10g彻底绞碎的肉样品中加入25mL水，均质2min后转移到平底烧瓶，加入50mL乙醚，振荡30min后转移到分液漏斗，收集乙醚层并经无水硫酸钠过滤，乙醚重复提取1次，合并提取液并蒸干。5～10mL乙醚和约1mL浓盐酸加到蒸干的提取物中，调pH1～2，55℃水浴旋转蒸馏，残留物转移到分液漏斗，加入100mL水、15g硫酸铵和25mL三氯甲烷，收集三氯甲烷层并经无水硫酸钠过滤，检测肉和肉制品中DES等药物残留，该方法LOD分别为0.2mg/L和0.3mg/L，回收率为75%～80%。