9.2.2.7 分析条件的选择

(1) 试样制备

牛尿为液体样品，可直接取10mL牛尿于50mL离心管中，3000r/min离心15min后，将尿液中少量悬浮物沉淀，取3mL上清液，加入含有玉米赤霉醇-4氘代和己烯雌酚-8氘代内标物的试管中，涡旋30s溶解混匀，即可。

(2)免疫亲和柱净化

本方法对比实验了Euroclone公司和Randox公司两种免疫亲和柱。Euroclone公司的免疫亲和柱对玉米赤霉醇和二苯乙烯类激素同时吸附，操作较为简单，但由于该柱的柱容量较小(玉米赤霉醇10ng，己烯雌酚10ng，己烷雌酚5ng，双烯雌酚5ng)，用于多组分分析回收率的重现性较差。Randox公司的免疫亲和柱分为玉米赤霉醇净化柱和二苯乙烯类激素净化柱两种，该柱操作较前者略复杂，但柱容量较大(玉米赤霉醇100ng，己烯雌酚50ng，己烷雌酚50ng，双烯雌酚50ng)，检测灵敏度高，回收率重现性较好。因此，最终本实验选择了Randox公司的免疫亲和柱。柱平衡、淋洗和被测物的洗脱，所用溶液以及流速控制，均按照Randox公司试剂盒中提供的使用操作说明书执行。

(3)质谱条件的优化

采用注射泵直接进样方式，以5μL/min将玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚和双烯雌酚的标准溶液分别注入串联质谱的离子源中。一级质谱分析(Q1，母离子扫描)比较了电喷雾电离(ESI)的正方式和负方式，4种被测物均在负方式条件下得到了较高的响应值，确定了准分子离子峰(M-1)，优化了去簇电压(DP)。对被测物的准分子离子碰撞后，进行二级质谱分析(MS2，子离子扫描)，得到子离子质谱图，见图9-3。对每种被测物选定的子离子进行碰撞气能量(CE)的优化。在连接了液相色谱仪后，尝试采用大气压化学电离(APCI)负方式进行测定，发现APCI(-)电离方式检测灵敏度更高些。通过对APCI(-)条件下离子源温度、雾化气压力、气帘气压力、辅助气1压力、喷雾器电流等参数优化，以优化后本方法提供的参数对被测物进行检测，玉米赤霉醇和己烷雌酚的方法最低检出限可达0.25μg/kg，己烯雌酚和双烯雌酚的方法检出限为0.5μg/kg，可满足日常检测和残留监控的玉米赤霉醇为0.5μg/kg，二苯乙烯类激素残留为1μg/kg要求。

(4)HPLC条件的优化

玉米赤霉醇和二苯乙烯类激素多采用C18柱进行分离，也有用C8柱的报道，但采用LC-MS-MS分析时，更多关注的是柱效和检出限，而对分离度不作为重点。先后试用了Waters公司、Agilent公司、Merck公司等多个品牌的C18和C8柱，经比较Agilent公司的ZORBAXSB C8 (150mm×4.6mm，3.5um)对玉米赤霉醇和二苯乙烯类激素的分析效果更好一些。

采用APCI电离时，乙腈为首选流动相，流速1mL/min。在此前提下试验了不同流动相比例和梯度程序。由于流速较高，乙腈比例不宜低，最终选定乙腈-水=70+30。对比了不同梯度洗脱程序的分离结果，没有明显改善，因而选定了固定比例流动相。

9.2.2.8 线性范围和检测低限

配制玉米赤霉醇、己烷雌酚的浓度分别为1.25ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL，己烯雌酚、双烯雌酚的浓度分别为2.5ng/mL、5.0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL的混合标准溶液，以本方法的测试条件，进样50μL进行测定，用经过内标校正的峰面积对标准溶液中各被测组分的浓度作图，其各目标物在检测范围内均呈线性关系，线性方程和相关系数见表9-9。由于被测物均为禁用兽药，因此，实验以最低检测限(MRL)的1/2为最低检测，10倍的MRL为上限进行检测。从表9-9数据可知，在此范围被测物含量与质量色谱峰面积呈线性关系。

9.2.2.9 方法回收率和精密度

用不含玉米赤霉醇和己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚的牛尿样品做添加回收和精密度试验，样品添加不同浓度标准后，按本方法进行样品制备、净化和测定，分析结果见表9-13。由表9-13结果看到，在相当方法检出限0.25/0.50μg/kg，回收率为62.9%～117.6%，相对标准偏差为13.67%～21.63%；在方法限量0.5/1.0μg/kg，回收率为65.5%～119%，相对标准偏差为13.42%～24.19%。

表9-13 4种激素添加回收率实验数据(n=10)

9.2.2.10 重复性和再现性

在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，如果差值超过重复性限(r)，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)。被测物的含量范围、重复性和再现性方程见表9-14。

表9-14 含量范围及重复性和再现性方程

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