9.1.4.2 测定方法

目前，国内外报道的动物源基质中非甾类同化激素的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、毛细管电泳法(CE)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、伏安法、流动注射-化学发光检测法(FI-CL)以及免疫分析法(IA)等。

(1)伏安法(voltammetry)

伏安法是一种电化学分析方法，根据指示电极电位与通过电解池的电流之间的关系，而获得分析结果，包括循环伏安法(cyclic voltammetry，CV)和差示脉冲伏安扫描法(differential pulse voltammetry，DVP)等。Biryol等利用酚羟基的电化学活性，分别研究了使用CV和DVP来检测血清中的DES含量。结果显示，CV的检测范围为2×10-5～6×10-4 mol/L，DVP的检测范围分别为1×10-5～1×10-3 mol/L(甲醇溶液)和4×10-5～6×10-4 mol/L(乙腈溶液)。CV的LOD为1.12×10-5 mol/L，DVP的LOD分别为8.85×10-6 mol/L(甲醇溶液)和1.14×10-mol/L(乙腈溶液)。

(2)流动注射-化学发光检测法(flow injection-chemiluminescence，FI-CL)

CLD是近年来发展起来的一种快速、灵敏的新型检测器，其原理是基于某些物质在常温下进行化学反应，生成处于激发态势反应中间体或反应产物，当它们从激发态返回基态时，就发射出光子。由于物质激发态的能量是来自化学反应，故叫作化学发光。当分离组分从色谱柱中洗脱出来后，立即与适当的化学发光试剂混合，引起化学反应，导致发光物质产生辐射，其光强度与该物质的浓度成正比。Zhang等报道了采用流动注射-化学发光(FI-CL)方法筛选肌肉、牛肉、羊肉和猪肉中的DES。样品经甲醇超声辅助提取，三氯甲烷脱脂，在硫酸溶液中用铈(IV)-罗丹明6G化学发光体系测定。该方法的线性范围为0.75～1.12pg/mL，回收率为93.1%～104.5%，日内和日间CV低于3.0%。

(3)毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)

CE是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，具有分离度高、快速、进样量少、有机溶剂消耗少、样品前处理要求低，已用于多种基质中非甾类同化激素残留的检测。但由于CE进样量小，也限制了其检测灵敏度。林子俺等建立了水产品中HES、DES及DIS残留的CE-UVD检测法，并研究了缓冲体系的酸度、浓度、添加剂、分离电压、进样时间以及温度等对组分分离的影响。雌酚类物质由于2个苯环上各有1个羟基，在碱性条件下极易电离形成带负电荷的离子，有利于减缓迁移速率以达到分离，随着pH的升高，毛细管内层表面的负电荷增加，电渗流加大，迁移时间相应缩短，但分离效果不显著，当pH大于10.0时，被测组分的迁移时间逐渐增长，分离趋势明显。在检测波长为200nm，分离电压为20kV，运行缓冲液为50mmo/L硼砂-25mmol/L氢氧化钠(pH12.3，含30%的N，N-二甲基甲酰胺)的条件下，3种目标组分在14min内达到基线分离；HES、DES与DIS的质量浓度与峰面积分别在210～120mg/L、110～100mg/L、110～100mg/L范围内呈良好线性，相关系数(r2)分别为0.9998、0.9992、0.9994；LOD为0.3～0.9mg/L。

(4)气相色谱法(gas chromatography，GC)

非淄类同化激素可以采用GC进行分析，但必须在GC分析之前将其衍生成挥发性的衍生物。由于操作较为繁琐，目前采用逐渐减少。Coffin等报道了用GC检测动物组织中的DES残留。利用DES溶解于碱性溶液的性质，用NaOH溶液和三氯甲烷反复萃取，三氟醋酸酐作为衍生化试剂，电子捕获检测器(ECD)检测。其检测限可达2～10μg/L，回收率为70%～110%。Tirpenou等对Coffin的研究方法进行了改进。用苯溶液和NaOH溶液提取样品中的DES，提取液经硅胶柱净化后检测，回收率达到81%。Barkatina等使用中等极性的HP-50毛细管柱和ECD检测肉和肉制品中DES等药物残留。样品用乙醚提取，盐酸酸化水解，经硅胶柱分离，再用C18固相萃取柱净化，然后经三氟醋酸酐或七氟丁酸酐衍生化，GC检测。该方法的LOD分别为0.2mg/L和0.3mg/L，回收率为75%～80%。

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