9.2.3.1 适用范围

适用于河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的液相色谱-串联质谱测定。方法检出限：均为1.0μg/kg。

9.2.3.2 方法原理

河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留，用叔丁基甲基醚和乙酸盐缓冲液加酶解剂提取试，经硅胶柱净化，用液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。

9.2.3.3 试剂和材料

叔丁基甲基醚、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷：色谱纯；乙酸、氢氧化钠：优级纯；乙酸钠(CH3COONa·3H2O)分析纯。

3mol/L氢氧化钠溶液：称取120g氢氧化钠溶于1000mL去离子水中；0.2mol/L乙酸盐缓冲液(pH=5.2)：称取2.52g乙酸和12.95g乙酸钠溶解于800mL水中，用氢氧化钠溶液调节pH至5.2±0.1，加水定容至1000mL；溶解液：正已烷-二氯甲烷(3+2，v/v)；淋洗液：乙酸乙酯-正己烷(3+47，v/v)；洗脱液：乙酸乙酯-正己烷(3+2，v/v)。

β-葡糖苷酸酶/硫酸酯复合酶：含β-葡糖苷酸酶124400units/mL，硫酸酯酶3610units/mL。

激素及代谢物标准物质：玉米赤霉醇(包括a-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇，各50%)纯度≥97%；玉米赤霉酮，纯度≥97%；己烯雌酚，纯度≥99%；己烷雌酚，纯度≥98%；双烯雌酚，纯度≥98%。

标准溶液：分别准确称取适量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚标准物质，用甲醇配制成1mg/mL标准贮备溶液。再根据需要以甲醇配制成不同浓度的混合标准溶液作为标准工作溶液，保存于4℃冰箱中。

内标标准物质：a-玉米赤霉烯醇-4氘代，纯度≥99%；己烯雌酚-8氘代，纯度≥98%。

内标标准溶液：准确称取适量a-玉米赤霉烯醇-4氘代和己烯雌酚-8氘代标准物质，用甲醇分别配制成1mg/mL标准贮备溶液。再以甲醇稀释成适用浓度的混合内标工作溶液，保存于4℃冰箱中。

硅胶固相萃取柱：500mg，3mL。

9.2.3.4仪器

液相色谱-串联质谱联用仪：配有电喷雾电离源；分析天平：感量0.1mg和0.01g；自动固相萃取仪或固相萃取装置；高速均质器：转速大于10000r/min；氮气吹干仪；烘箱：控温精度±1℃；涡旋振荡器；离心机：转速大于3000r/min；pH计：测量精度±0.3pH单位；具塞离心管：25mL，50mL；微量注射器：100μL。

9.2.3.5 样品前处理

(1) 试样制备

取有代表性样品500g，绞碎后搅拌均匀，制成实验室样品。试样分为两份，置于样品盒中，密封，并做上标记。将试样于-18℃下保存。

(2) 样品称取

称取5个阴性样品，每个样品为5g(精确到0.1g)，将上述样品置于50mL离心管中分别加入适量混合标准工作溶液，使各被测组分玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烷雌酚、已烯雌酚和双烯雌酚的浓度分别为2.5ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。再分别加入适量内标标准工作溶液，使其浓度均为10ng/mL。

(3) 提取

加入20mL叔丁基甲基醚，在10000r/min均质1min。3000r/min离心5min，将上清液全部转移至另一50mL具塞离心管中备用。离心管中的残渣置于通风橱中挥发30min，加入15mL乙酸盐缓冲液，高速均质1min，3000r/min离心5min，将上清液全部转移至另一25mL具塞试管中，并在氮吹仪上于40℃水浴中吹去残余叔丁基甲基醚后，加入80μL β-葡糖苷酸酶混匀，于52℃烘箱中放置过夜。在此缓冲溶液中加入氢氧化钠溶液将溶液pH调至7，加入10mL叔丁基甲基醚，充分混合，3000r/min离心2min。移取叔丁基甲基醚层与前述的叔丁基甲基醚提取液混合，在氮吹仪上于40℃水浴中吹干。加入1mL溶解液，涡旋30s溶解，待净化。

(4) 净化

固相萃取净化条件：用6mL正己烷分两次预洗硅胶柱，流速均为4mL/min。上样，流速为2mL/min，在样品试管中加入3mL淋洗液，混合后过柱，流速为2mL/min，用3mL淋洗液以3mL/min的速度淋洗，加入2mL空气以4mL/min的速度吹过硅胶柱。用6mL洗脱液洗脱，流速为2mL/min，加入2mL空气以6mL/min的速度吹过硅胶柱，收集洗脱液。将洗脱液在氮吹仪上于40℃水浴中吹干，加入1mL流动相，涡旋30s溶解。溶液过0.2μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定。

(5) 实测样品溶液的制备

称取待测样品5g(精确到0.1g)于50mL离心管中，加入内标工作溶液，使其最终定容浓度均为10ng/mL。按上述步骤操作。

(6) 空白基质溶液的制备

称取阴性样品5g(精确到0.1g)于50mL离心管中，按上述步骤操作。

(7) 基质标准工作溶液

将标准工作溶液及内标标准工作溶液混合后在氮吹仪中吹干，以基质提取液溶解，涡旋30s后即为基质标准工作溶液。