9.2.1.7 分析条件的选择

(1)被测物的提取

本方法试验了用乙酸乙酯和叔丁基甲基醚(MTBE)进行提取，其结果见表9-5。由表9-5可见，乙醚和MTBE提取玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的效率相当，而对于二苯乙烯类激素则MTBE作为提取溶剂回收率较好，因而最终选取MTBE作为提取溶剂。

表9-5 不同溶剂提取对回收率的影响

动物源性样品中玉米赤霉醇和二苯乙烯类激素以两种形式存在，即游离态和与蛋白结合态，加入β-葡糖苷酸酶可使结合态的玉米赤霉醇和二苯乙烯类激素水解成游离态。本实验在基质中添加结合了单葡萄糖醛酸的己烯雌酚标准物质，模拟比较酶解前后己烯雌酚的回收率，结果表明酶解后回收率提高30%以上，因而在实际样品测定中酶解是必不可少的步骤。本方法采用两步提取:先用MTBE提取样品中游离态的组分，转移出MTBE后，将样品残渣中残余MTBE除净，将乙酸盐缓冲液中加入残渣后，加入酶解剂水解，中和后用MTBE抽提，这样可保证游离态的和与蛋白结合态的玉米赤霉醇和二苯乙烯类激素都能有效提取。

(2)固相萃取净化

LC-MS/MS具有较高的检测灵敏度，但复杂的基质背景会抑制目标化合物的离子化效率，大大降低被测组分的检测灵敏度，而且样品净化程度对结果重现性也有很大的影响。本方法采用硅胶柱进行SPE净化处理，比较了不同牌号的硅胶柱，发现美国J.T.Baker公司Bakerbond SPE Sillica Gel(SiOH) Column (500mg)回收率相对较高，因而最终选择用Bakerbond SPE硅胶柱。

本方法检测的5种类雌激素及代谢物要求限量低，基质复杂，因此考虑应用自动固相萃取仪(AS PE)减少人为因素误差，提高重现性。对淋洗液比例、洗脱液比例、洗脱液用量各项参数进行优化,结果见表9-6至表9-8。

表9-6 淋洗液比例对回收率的影响(淋洗液用量6mL)

表9-7 洗脱液比例对回收率的影响(先用乙酸乙酯-正己烷[6+94]淋洗，再行洗脱)

表 9-8 洗脱液用量对回收率的影响(分三次洗脱，每次用量3mL)

实验检测的目标物为两类，玉米赤霉醇及代谢物和二苯乙烯类激素。两类物质性质上存在差别，因而在确定最终实验条件时需兼顾两类物质。由表9-7可见，淋洗液比例只能选用乙酸乙酯-正已烷(6+94，v/v)，6mL。由表9-8实验结果得出，应用乙酸乙酯-正己烷(60+40，v/v)洗脱液可得到全部目标物较高的回收率。由表9-9实验结果得出，应用6mL洗脱液能将待测物洗脱约90%，再增加洗脱液用量回收率没有明显提高，但吹干时间将延长。最终确定了本实验淋洗液比例、洗脱液比例、洗脱液用量各项参数。

(3) 质谱条件的优化

采用注射泵直接进样方式，以5μL/min将玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚和双烯雌酚的标准溶液分别注入串联质谱的离子源中。一级质谱分析(Q1，母离子扫描)比较了电喷雾电离(ESI)的正方式和负方式，5种被测物均在负方式条件下得到了较高的响应值，确定了准分子离子峰[M-1]，优化了去簇电压(DP)。对被测物的准分子离子碰撞后，进行二级质谱分析(MS2，子离子扫描)，得到子离子质谱图，见图9-3。

图9-3 五种化合物二级质谱图

对每种被测物选定的子离子进行碰撞气能量(CE)的优化。在连接了液相色谱仪后，尝试采用大气压化学电离(APCI)负方式进行测定，发现APCI(-)电离方式检测灵敏度更高些。通过对APCI(-)条件下离子源温度、雾化气压力、气帘气压力、辅助气1压力、喷雾器电流等参数优化，确定了本方法最终分析参数。以优化后本方法提供的参数对被测物进行检测，玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烷雌酚的方法最低检出限可达0.25μg/kg，己烯雌酚和双烯雌酚的方法检出限为0.5μg/kg，可满足日常检测和残留监控要求。

(4)HPLC条件的优化

本方法先后试用了Waters公司、Agilent公司、Merck公司等多个品牌的C18和C8柱，经比较Agilent公司的ZORBAX SB C8(150mm×4.6mm，3.5μm)对玉米赤霉醇和二苯乙烯类激素的分析柱效更好一些。

采用APCI电离时，乙腈为首选流动相，流速1mL/min。在此前提下试验了不同流动相比例和梯度程序。由于流速较高，乙腈比例不宜低，最终选定乙腈-水=70+30。对比了不同梯度洗脱程序的分离结果，没有明显改善，因而选定了固定比例流动相。