10.2.1.7 分析条件的优化

(1) 提取净化条件的优化

糖皮质激素药物属于脂溶性激素，在结构上都是环戊烷多氢菲衍生物，所以采用乙酸乙酯作为提取剂能够有效地从河豚鱼、鳗鱼及烤鳗样品提取此类药物。在参考农业部1031号公告-2-2008方法基础上，首先对样品的提取步骤进行了实验，在实验中发现，称取样品后，先进行氢氧化钠溶液的皂化步骤，然后用乙酸乙酯提取，虽然经过皂化后，提取的油脂相对较少，并且经过Cleanert Silica固相萃取柱的净化后，泼尼松龙、泼尼松、氢化可的松、可的松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松的回收率也令人满意，但倍氯米松、醋酸氟氢可的松的回收率很低。先用乙酸乙酯提取一次后，再进行氢氧化钠皂化，倍氯米松、醋酸氟氢可的松的回收率有所提高，但回收率仍然达不到60%，这说明氢氧化钠的皂化步骤影响倍氯米松、醋酸氟氢可的松的提取。所以本方法在进行河豚鱼、鳗鱼及烤鳗样品样品的提取步骤时，减少了皂化步骤。在确定的方法中，称取5g样品后，加入15g无水硫酸钠，以减少水分，分散鱼肉组织和防止鱼肉样品在振荡时产生结块，加入25mL乙酸乙酯，用均质器均质1min，在振荡器振荡20min，以10000r/min离心10min，取.上清液至梨形瓶中。再用25mL提取一次，合并上清液，用旋转蒸发器于45℃水浴上减压蒸发至近干，用1mL乙酸乙酯和5mL正己烷溶解，待净化。本方法对乙酸乙酯的提取效率也进行了实验。在对添加了高浓度的糖皮质激素混合标准工作溶液的河豚鱼肉样品用乙酸乙酯提取二次后，再用25mL乙酸乙酯提取一次，按照本方法规定的操作步骤进行测定，未检出糖皮质激素残留。

在本方法的研究中，主要对Cleanert Silica固相萃取柱的净化效果和洗脱效率进行了实验。取500μL浓度为0.05μg/mL的糖皮质激素混合标准工作溶液，在氮气吹干仪.上吹干，用1mL乙酸乙酯和5mL正己烷溶解，用移液器分三次移至已用6mL正已烷预处理的Cleanert Silica固相萃取柱中，分别三次收集流出物于10mL样品管中；然后用3×2mL正己烷洗涤Cleanert Silica固相萃取柱，分三次将收集流出物于10mL样品管中；再用3×2mL丙酮+正己烷(4+6)洗脱剂洗脱固相萃取柱，分三次收集流出物于10mL样品管中；将九个样品管用氮气吹干仪吹干，分别用1mL 20%乙腈水溶解，液相色谱-串联质谱仪测定。经过试验发现，1mL乙酸乙酯和5mL正已烷，6mL正己烷均未将糖皮质激素洗脱下来，6mL丙酮+正己烷(4+6)可以将萃取柱.上的糖皮质激素洗脱下来。另外用乙酸乙酯和正己烷可将大部分油脂和干扰物洗脱下来。所以，Cleanert Silica固相萃取柱的净化效果令人满意。本方法也对OasisHLB固相萃取柱进行了实验，对于河豚鱼、鳗鱼及烤鳗样品的净化，无论从操作步骤、洗脱条件和净化效果都不如Cleanert Silica固相萃取柱。

(2)色谱和质谱条件的优化

本方法采用AB公司生产的3200 Q TRAP型号液相色谱-串联质谱仪进行条件实验。由于9种糖皮质激素化合物极性存在一定差异，所以采用梯度洗脱方法实现分离。由于泼尼松龙和可的松，倍他米松和地塞米松的母离子和子离子完全相同，在质谱上无法区分，所以必须通过色谱实现分离，另外，由于倍氯米松、醋酸氟氢可的松出峰较晚，并且灵敏度相对较低，这就要求流动相中乙腈和水的比例要达到即能达到倍氯米松、醋酸氟氢可的松分离，又要使倍氯米松、醋酸氟氢可的松的灵敏度达到要求，所以本方法最终采用的梯度洗脱程序见下表10-1。本方法经过优化梯度程序，实现了九种化合物的分离。

在ESI(-)模式下，糖皮质激素化合物形成[M-H+HCOOH]-形式的分子离子峰，通过碰撞处理，子离子扫描进一步得到定量和定性子离子碎片峰，进而采用MRM模式进行监测。本方法还对气帘气压力，雾化气压力，辅助加热气压力，去簇电压，碰撞能量进行了优化，使方法灵敏度达到了检测需要。