(8)免疫分析法(Immunoassay，IA)

免疫学分析方法以抗原抗体的特异性反应为基础的，以高特异性、高灵敏度著称，可使分析过程简化，适合复杂基质中痕量组分的分析。QNs结构中含有羧基，故多采用羧基与载体蛋白游离氨基进行反应，将QNs与载体连接合成人工抗原，进而免疫动物产生特异性抗体。由于QNs的主要结构部分相同或相似，因此某一QNs的抗体通常对其他QNs存在--定的交叉反应。常采用的方法主要有酶联免疫吸附(ELISA)、胶体金免疫层析(CGIA)、化学发光酶免疫分析(CLEIA)、荧光偏振免疫分析方法(FPIA)和磁微粒酶联免疫技术(MPEIA)等。

1)酶联免疫分析法(enzymelinkimmunosorbentassay，ELISA)

ELISA已广泛应用于兽药和农药残留的快速筛选检测。大多数ELISA方法的标记物是酶，但是也有应用其他标记物建立的方法，如化学发光法和电化学法。相对于微生物学方法和色谱方法而言，ELISA方法可以适用于大量样本的快速分析，灵敏度高，成本低，不需要昂贵复杂的仪器，在残留检测中有着非常突出的优势。除了常用的96孔酶标板，一些实验室已经开始使用384或1536孔的酶标板，可以显著提高工作效率。

姜金庆等建立了同时检测多种QNs的ELISA分析方法。以碳二亚胺(EDC)二步法合成CIP人工抗原，免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，建立QNs药物多残留的ELISA检测方法。标准曲线在PBS中的线性检测范围为0.2～376ng/mL，IC50为8ng/mL，LOD为0.1ng/mL；抗体对ENR、NOR和PEF均能特异性识别，IC50值分别为7.3ng/mL、10.6ng/mL和13.2ng/mL；标准品稀释液中NaOH和甲醇的最高容忍度分别为10%和30%。牛奶中添加5ng/mL、20ng/mL和50ng/mL的标准品，CIP、ENR、NOR和PEF的回收率分别为93%～108%、96%～110%、92.5%～104%和93%～102%。Bucknall等制备了NOR的多克隆抗体，采用ELISA检测牛奶、羊肾脏中NOR、ENR、CIP、FLU和NAL残留，方法的回收率为64.2%～110.6%，日内和日间RSD分别低于11.2%和10.5%，LOD低于4mg/kg。

Huet等制备的SAR单克隆抗体对SAR、NOR、FLU等15种QNs都有交叉反应性。鸡肌肉、鸡蛋、肾脏等组织经甲醇磷酸盐提取后，用建立的ELISA方法进行检测，LOD为10～200ng/g。Lu等以PEF为半抗原，与牛血清白蛋白偶联，免疫动物制备抗体，该抗体具有高敏感性，在缓冲液中对PEF的IC50为6.7ppb，对FLE、ENR、OFL的交叉反应性分别为116%、88%和10%，在0.5ppb、5ppb、10ppb、50ppb和100ppb添加水平，平均回收率为87%～103%，日间和日内RSD分别低于为13.6%和10.9%，方法的LOQ为0.5ppb。VanCillie等利用制备的FLU人工抗原免疫产蛋鸡，收集鸡蛋并对IgY进行分离、鉴定，建立间接竞争ELISA方法，用于测定牛奶中的FLU。生牛奶中FLU的LOD为12.5ug/kg，平均回收率为73.7%。Sheng等建立了检测牛奶中OFL、MAR和FLE的直接竞争ELISA方法，LOD为0.20～0.53ng/mL。Holtzapple等制备了SAR的单克隆抗体和多克隆抗体，使用分子力学和量子力学的方法获得了的三维分子模型，并讨论了交叉反应与结构的关系和不同结构部分对免疫结合反应的作用，使得对待测物与抗体的结合有了更好的理解，由此也说明利用计算机和分子模型技术设计半抗原和预测抗体选择性是可行的。Jiang等以辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔二抗来识别磺胺类药物(SAs)的多克隆抗体，以碱性磷酸酶ALP标记羊抗鼠二抗来识别QNs单克隆抗体，从而实现在同一个反应体系中同时检测牛奶中22种SAs和13种QNs残留的双显色酶联免疫吸附试验(DC-ELISA)。该DC-ELISA方法对SAs和QNs的LOD分别为5.8μg/L和2.4μg/L；SAs和QNs在牛奶中10～100μg/L添加浓度，SAs的添加回收率为67%～101%，CV为8.1%～16.4%；QNs的添加回收率为72%～105%，CV为4.8%～9.3%。

2)胶体金免疫层析法(colloidalgold-based immunochromatographi cassay，CGIA)

CGIA是20世纪70年代开始发展起来的一种以胶体金作为标记物，让其和蛋白质等各种大分子物质结合，再利用抗原抗体反应以达到检测目的的一种新型的免疫标记技术。胶体金技术具有方便快捷、特异性强、敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点，目前已开始应用于小分子物质的检测，如毒素、药残、环境监测等领域，随着胶金技术的逐步推广，替代ELISA方法成为各检测机构、广大基层部门进行样本大规模筛选的首选方法势在必行。刘烜等建立用于快速检测肉、鱼、虾等组织中QNs残留的CGIA方法。采用免疫竞争法，将抗QNs单克隆抗体-胶体金复合物包被在胶体金结合垫上，并将人工合成的QNs抗原包被在硝酸纤维素薄膜表面作为检测线(T线)，以颜色直观显示检测的定性结果，灵敏度最低值可达到10ng/mL。Sheng等建立了检测牛奶中OFL、MAR和FLE的CGIA方法，LOD为0.02～0.05ng/mL。

3)化学发光酶免疫法(chemiluminescenceenzyme-linkedimmunoassay，CLEIA)

CLEIA由化学发光分析系统和酶联免疫反应系统两部分构成。化学发光分析系统是指化学发光物质或者酶经催化氧化反应释放大量自由基使之形成-一个不稳定的激发态中间体，待其恢复到稳定基态后，多余的能量以光子的形式发射出来，经发光信号测量仪器可检测其发光强度。而酶联免疫反应系统是指经催化反应参与发光的酶标记的生物活性物质(抗原或抗体)进行特异性抗原抗体免疫反应后，形成抗原抗体免疫反应复合物。然后根据测定的发光强度和催化反应参与发光的标记酶的关系进行定量分析。CLEIA具有设备仪器简单、操作方便、灵敏度高、特异性强、专一性、线性动力学范围广、易实现自动化和不具有放射性污染诸多优点。李源珍等建立可同时检测牛奶中OFL、MAR、FLE残留的直接竞争化学发光酶免疫法(dc-CLEIA)，方法的LOD分别为0.01ng/mL、0.03ng/mL、0.04ng/mL。牛奶中的OFL、MAR、FLE用7.5%的三氯乙酸提取，200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL5个添加水平的平均回收率在75.4%～94.1%之间。张慧丽等建立了CLEIA法测定牛奶中ENR残留，将牛奶样品中的ENR与标记有碱性磷酸酶的ENR同时与限量的特异性固相ENR抗体进行竞争结合反应，通过分离未结合的标记抗原，测定标记抗原与抗体复合物化学发光强度，经相应的数学函数计算出待测抗原的含量，快速地测定牛奶中ENR残留量，方法的LOD为239.9pg/mL，检测范围为350～1000pg/mL，批内与批间RSD均小于15%。

4)荧光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)

FPIA与ELISA方法相比较，FPIA简化了操作步骤且缩短了操作时间，把非均相的反应系统转换为均相的反应系统，是一种简单、可靠、快速和高效的免疫分析方法。Mi等建立了可同时检测牛奶中5种QNs和鸡肉中6种QNs残留的单试剂FPIA方法。以最佳荧光标记物SAR-5-羧基荧光素与QNs广谱识别性单克隆抗体制备了免疫复合物单试剂，所建立的单试剂FPIA灵敏度高且反应速度快，将样品与单试剂充分混合后不需要进一步温育便可直接检测。本方法对CIP的LOD为0.75ng/mL，IC50为2.17ng/mL，检测范围为1.2～4.0ng/mL，该方法对牛奶中5种QNs的CCβ均小于15ng/mL，对鸡肉中6种QNs的CCβ均小于50ng/mL，添加空内牛奶和鸡肉样本的平均回收率为77.8%～116%，CV低于17.4%。宋佩等以异硫氰酸荧光素(FITC)标记沙拉沙星(SAR)合成荧光标记物，采用薄层色谱法提纯，优化了反应时间、标记物和抗体的工作浓度，建立了SAR的快速FPIA分析法。该方法测定SAR在缓冲液中的IC50为43.2ug/L，检测范围为5.7～327μg/L；同时考察了FPIA测定SAR的动力学过程及对其他4种QNs的交叉反应。结果表明CIP、ENR、DAT及OFL的交叉反应率分别为3.3%、1.8%、1.7%和0.7%；在牛奶和猪尿中SAR的回收率分别为71%～94%和74%～102%。

5)磁微粒酶联免疫法(magnetic particle-based enzyme immunoassay，MPEIA)

MPEIA将磁微粒应用到ELISA中，取代传统的酶标板固相载体，并利用磁性微珠在磁场下能够进行分离的原理，磁微粒与单克隆抗体连接，即为免疫磁珠，与相对应的检测抗原结合后，在磁场的作用下，特异结合的抗原与其他未反应物质分离，最后通过酶联免疫显色反应测定抗原含量。MPEIA克服了普通ELISA测定中的一些缺点，更具优越性。Zhang等制备了CIP的特异性单克隆抗体，建立了MPEIA法检测鸡肌肉中的CIP，在0.3～24.3ng/mL浓度范围内，IC50和LOD分别为2.27ng/mL和0.25ng/mL。在鸡肌肉中，CIP添加量为8ng/mL、20ng/mL和40ng/mL时，回收率均大于79%。建立的MPEIA分析法和ELISA呈现出极好的相关性。抗CIP单克隆抗体与8种QNs有着较高的交叉反应率：ENR(110.1%)、SAR(99.7%)、DIF(75.1%)、DAN(89.8%)、NOR(110.3%)、LOM(65.2%)、OFL(75.1%)和FLU(45.0%)。此方法具有分离简单、反应均匀、检测快速(30min内)和结果稳定等优点。

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