11.2.3.7 分析条件的选择

(1)样品前处理方法的优化

牛奶和奶粉中含有大量的脂肪和蛋白质，传统的提取方法容易产生乳化现象。尝试用10%三氯乙酸：乙腈(9：1)作为提取剂，采用HLB，60mg/3cm3(WatersOasis)净化，7种喹诺酮的回收率在43%～64%之间。将1%偏磷酸：乙腈(7：3)作为提取剂，浓缩乙腈后同样采用HLB，60mg/3cm3(WatersOasis)净化，回收率较低。结果表明，加入沉淀剂以后提取溶液容易净化，但是回收率偏低，可能在沉淀蛋白的同时造成药物的络合或挟裹，造成损失。鉴于乙腈本身具有沉淀蛋白的作用，且条件较为温和，采用乙腈及酸化乙腈作为提取剂，经过大量的试验确定了乙腈及酸化乙腈的用量；通过结果比较，乙腈与酸化乙腈没有显著差异，最终确定以乙腈作为提取溶剂的实验方案。试验证明，提取两次的回收率远大于提取一次。参考GB/T20757-2006《蜂蜜中十四种喹诺酮类药物残留量的测定方法液相色谱法-串联质谱法》，提取剂中加入pH=3磷酸盐溶液，同时解决了乙腈沉淀蛋白能力较强，第二次提取时牛奶和奶粉中的固状物不能充分在乙腈中溶解出现絮状沉淀的问题。

固相萃取技术是比较有效的净化手段，本方法对比了HLB，60mg/3cm3(WatersOasis)、MCX60mg/3cm3(WatersOasis)、BONDELUT-SCX，500mg/3mL三种固相萃取柱的净化效果，试验表明三种固相萃取柱的净化效果均良好，但HLB柱回收率略高，因此本方法选择HLB柱作为净化柱。由于采用HLB柱净化，上样液中不能含有太多的乙腈，因此需要将提取液中的乙腈蒸干。

洗脱时，做流出曲线，采用3mL5%氨水甲醇可将7种喹诺酮完全洗脱下来，所以采用4mL 5%氨水甲醇作为洗脱液。该七种药物中达氟沙星热稳定性差，在45℃氮吹吹干，就有将近50%的损失，浓缩一步应注意不能将其完全吹干，待洗脱液吹至约0.2mL时，利用定容液将其补至1mL。

(2)色谱条件的建立

实验采用了0.1%乙酸-甲醇做流动相，采用梯度洗脱，在150mm×2.1mm(i.d.)，粒度5μum的C18柱上，分析物得到了有效的分离，且峰形对称尖锐。

(3)质谱条件的优化

用蠕动泵以10uL/min注入1μg/mL的7种喹诺酮混合标准溶液来确定各化合物的最佳质谱条件，包括选择特征离子对，优化电喷雾电压、鞘气、辅助气、碰撞能量等质谱分析条件。来确定各化合物的最佳质谱条件，包括选分析物的混标液进入ESI电离源，在正、负离子扫描方式下分别对分析物进行一级全扫描质谱分析，得到分子离子峰。7种分析物在正模式下均有较高的响应，负模式下信号值很低。然后对各分子离子峰进行二级质谱分析(多反应监测MRM扫描)，得到碎片离子信息。其具体的质谱条件为：鞘气压力，30unit；辅助气压力，5unit；正离子扫描模式；电喷雾电压，4000V；毛细管温度，320℃；源内诱导解离电压，10V；Q1和Q3狭缝宽度为0.4、0.7；碰撞气为高纯氩气，碰撞气压力为1.5mTorr。分析物的保留时间采集窗口确定定性定量离子对及碰撞能量见表11-11。

(4)定量方式的选择

实验对比了外标法和内标法两种定量方式，由于只有氘代环丙沙星和氘代恩诺沙星两种，且采用外标法定量回收率较高，精密度较好，因此，用外标法定量。

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