7.2.1.7 分析条件的选择和优化

(1) 衍生化条件的选择

本方法用2-NBA和4-NBA两种衍生剂，对比了阳性样品中AOZ、AMOZ、SEM和AHD残留的衍生化效果，结果发现，2-NBA比4-NBA灵敏度高。因此，选择2-NBA作为衍生剂。还对比了不同衍生剂用量对测定结果的影响。用灵敏度最低的AHD标准溶液，分别加入衍生剂0.05mg，0.1mg，0.2mg，0.5mg，1.0mg，5.0mg，10mg进行测定，响应值和衍生剂用量的关系结果见表7-6。

表7-6 衍生剂用量对测定结果(响应信号峰面积)的影响

从表7-5中看出，衍生剂加入量少于1.0mg，可能使被测物衍生不完全，若用量多于1.0mg，则在氮气吹干时，会有衍生剂结晶物，不易被流动相溶解，测定时有干扰。选择衍生剂用量为1.0mg。另外，实验对比了衍生溶液不同pH对测定结果的影响。阳性样品水解衍生后，加入3mL 0.1mol/L K2HPO4缓冲溶液，用NaOH溶液调到不同pH。不同pH时四种代谢物的测定响应值见表7-5。从表7-7可看出，衍生溶液pH在7.0～7.5之间时，四种代谢物的测定响应值最高，本方法选pH为7.4。

表7-7 不同pH四种硝基呋喃代谢物的响应信号(峰面积)

(2)净化条件的选择

实验了两种样品净化方式，一是衍生溶液调pH后用乙酸乙酯提取两次，离心合并乙酸乙酯层氮气吹干定容。这种方式提取效率较好，但是操作步骤比较繁琐，乙酸乙酯层不能全部取出。有时还出现乙酸乙酯和水相分层不彻底的情况，易产生干扰，从而影响结果准确性。二是采用固相萃取柱净化，比较了OasisMax (60mg，3mL Waters)，OasisHLB(60mg，3mL Waters)，OasisHLB(500mg，3mL Waters)，H2O-Philic DVB(60mg，3mL，Speedisk)，C18(500mg，3mL，J.T.Baker)和EN(200mg，3mL，MERCK)六种固相萃取柱的提取效率和净化效果，结果见表7-8。从结果表明，OasisHLB(60mg，3mL Waters)，OasisHLB(500mg，3mL Waters)，和EN(200mg，3mL，MERCK)柱的提取效率和净化效果都较理想，操作步骤比较简单，适合于大批量样品检测。进一步的比较表明，OasisHLB(60mg，3mL Waters)柱的重现性比EN(200mg，3mL，MERCK)柱好。同时，考虑到OasisHLB(500mg，3mL Waters)柱成本较高，因此，选择OasisHLB(60mg，3mL Waters)萃取柱作为样品净化柱。

表7-8 不同萃取柱四种硝基呋喃代谢物的响应信号(峰面积)

(3)液相色谱条件的选择

1)猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝、鱼类、虾蟹类和贝类样品

比较了Pinnacle II C18，5um，150mm×2.1mm；Inertsil ODS-3，5um，150mm×2.1mm，ZORBAX SB-C18，3.5μm，150mm×2.1mm和Atlantis-C18，3μm，150mm×2.1mm四种液相分析柱对四种硝基呋喃代谢物的分离效果，结果发现，Atlantis-C18分析柱，灵敏度和分离度都较理想。因此，选择该柱为分析柱。

为了优化流动相，对比了甲醇+乙酸水溶液、乙腈+乙酸水溶液作流动相的色谱效果，实验表明，乙腈+0.3%乙酸水溶液作为流动相并采用梯度洗脱时，四种代谢物的衍生物分离度和灵敏度较高。流动相梯度洗脱条件见表7-2。

2)牛奶或奶粉样品

比较了Inertsil ODS-3，5um，150mm×2.1mm，ZORBAXSB-C18，3.5um，150mm×2.1mm和Atlantis-C18，3um，150mm×2.1mm三种液相分析柱对四种硝基呋喃代谢物的分离效果，结果发现，Atlantis-C18分析柱，灵敏度和分离度都较理想。因此，选择该柱为分析柱。

为了优化流动相，对比了甲醇+甲酸水溶液、乙腈+甲酸水溶液做流动相的色谱效果，实验表明，乙腈+0.1%乙酸水溶液作为流动相并采用梯度洗脱时，四种代谢物的衍生物分离度和灵敏度较高。流动相梯度洗脱条件见表7-3。

3)蜂蜜样品

比较了Pinnacle II C18，5um，150mm×2.1mm；Hypersil C18 5um，150mm×4.6mm；Inertsil ODS-3，5μm，150mm×2.1mm，ZORBAXSB-C18，3.5um，150mm×2.1mm，四种液相分析柱对四种硝基呋喃代谢物的分离效果，结果发现，ZORBAXSB-C18，3.5um，150mm×2.1mm分析柱，灵敏度和分离度都较理想。因此，选择该柱为分析柱。

为了优化流动相，对比了甲醇+乙酸铵水溶液、乙腈+乙酸水溶液作流动相的色谱效果，实验表明，乙腈+0.4%乙酸水溶液作为流动相并采用梯度洗脱时，四种代谢物的衍生物分离度和灵敏度较高。流动相梯度洗脱条件见表7-4。

(4)质谱条件的选择

取四种硝基呋喃代谢物标准溶液20μg/mL，用2-NBA衍生化，分别得到2-NBA-AOZ，2-NBA-AM0Z，2-NBA-SEM，2-NBA-AHD标准衍生溶液。以5μL/min流速分别将四种代谢物标准溶液的衍生物注入离子源。在正离子检测方式下分别对其进行一级质谱分析(Q1扫描)得到分子离子峰。再对分子离子进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到二级质谱图，见图7-4。然后再对去簇电压(DP)、聚焦电压(FP)、碰撞气能量(CE)及碰撞室出口电压(CXP)等参数进行优化，使分子离子与特征碎片离子强度达到最大，确定最佳质谱参数。将液相色谱与质谱联机，对雾化气流量，雾化室温度，喷雾针位置等参数进一步优化，使各种参数达到最佳。

图7-4 四种硝基呋喃代谢物二级质谱图

(5)定量方式的选择

实验了外标法和内标法两种定量方式。标准溶液和样品溶液基质相同时，二者区别不大。标准溶液和样品溶液基质不同时，硝基呋喃代谢物衍生物的离子化效率不同，用内标法定量更准确。

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