(8)免疫分析法(immunoanalysis，IA)

免疫分析方法具有快速简便、灵敏度高等优点，主要用于筛选检测。吡唑酮类药物的免疫学方法研究主要是放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)，集中于20世纪80年代左右，近年来报道较少。RIA的原理是放射性标记抗原和未标记抗原(待测物)与不足量的特异性抗体竞争性地结合，反应后分离并测量放射性，而求得未标记抗原的量。

Takatori等最早制备4-重氮基安替比林免疫原。AA在酸性条件下，冰浴，将氨基重氮化，生成4-重氮基安替比林，再在碱性条件下与牛血清白蛋白偶联，多次免疫家兔获得安替比林抗体，建立了吡唑酮类药物RIA方法。通过[3H]标记的安替比林和未标记安替比林竞争性结合安替比林特异性兔抗血清，检测[3H]标记的安替比林进行定量，方法LOD为1ng，但未对实际样品进行测定。Takatori等还制备了琥珀酸酐安替比林抗原。由于安替比林缺乏与蛋白偶联的活性基团，而其代谢物AA则含有活性氨基。将AA和琥珀酸酐分别溶解于二氯甲烷，再将二者混合，室温下反应，反应产物用硅胶薄层层析，展开剂为甲醇氯仿(90+10，v/v)，收取4-氨基琥珀酸酐-安替比林，再与氯甲酸异丁酯衍生，衍生产物直接与牛血清蛋白偶联，获得完全抗原，再免疫家兔，获得抗体。该抗体的IC50分别为：安替比林6.8ng/mL，AA6.4ng/mL，安乃近2820ng/mL，氨丙吡酮8.5ng/mL，安乃近35.5ng/mL，IPA 1320 ng/mL，氨基比林2820ng/mL。 以此建立的RIA方法，安替比林的LOD为1ng/mL，与其他吡唑酮类药物无交叉反应，但未对生物样品进行测定。

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