(7)液相色谱-质谱法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)

HPLC法不能提供结构方面的信息，无法对目标化合物进行确证，也无法分析复杂基质中痕量残留化合物。LC-MS特别是液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)，集液相色谱高效分离与质谱的高鉴定能力于一体，在药物残留分析领域得到了广泛应用，推动了复杂基质(如动物肌肉、肝脏、肾脏)中多残留分析的发展。

由于吡唑酮类药物理化性质的不同(安乃近及其代谢物为碱性药物，而保泰松、羟布宗为酸性药物)，一般采取不同电离模式进行质谱测定。

1)碱性药物

安乃近及其代谢物显碱性，质谱检测电离一般选正离子模式。安乃近的二级代谢物FAA、AA和AAA性质较为稳定，采用外标法定量可以得到满意的结果；而其一级代谢物MAA稳定性相对较差，通常采用内标法进行定量。

沈金灿等建立了牛和猪肌肉中安乃近代谢物残留的LC-MS/MS分析方法。采用Atlantis C18色谱柱(150mm×2.1mm，3.5μm)分离，流动相为5 mmol/L乙酸铵溶液(pH 4.5)和乙腈，梯度洗脱，流速0.3mL/min；喷雾电压5.0kV，去簇电压40V，聚焦电压200V，碰撞室射入电压10V，碰撞室射出电压15V，去溶剂温度450℃，电喷雾(ESI)正离子、MRM模式检测。FAA和AAA采用外标法定量，AA和MAA以4-异丙氨基安替比林(4-iso propylaminoantipyrine，IAA)作为内标定量。FAA和AA的LOD为1.0μg/L，AAA和MAA为0.5 μg/L；在添加浓度5～200ng/g范围内，FAA的回收率为81.6%～94.0%，AAA为81.2%～90.2%，AA为82%～101%，MAA为78.5%～87.0%；RSD均在7%以内。研究表明，采用正离子模式进行质谱检测时，通常需要在溶液中维持一定的酸度使分析物容易质子化而带正电荷；然而pH太低，各组分的保留降低，容易与基质组分共洗脱而使其响应受到抑制。在pH4.5条件下，以5mmol/L醋酸铵缓冲体系作为流动相，各组分得到比较好的分离，并且质谱上有较强响应。实验还发现，即使在中性和室温条件下，低浓度的安乃近在缓冲溶液中也容易迅速转化成MAA。张骊等建立了猪肉中氨基比林、安替比林、安乃近代谢物FAA、AA、AAA和MAA残留检测超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)。色谱柱为Waters BEH C18(2.1mm×5mm，1.7um)，流动相为含0.1%甲酸的乙腈和0.1%甲酸溶液，梯度洗脱，柱温30℃，流速0.3 mL/mL；质谱条件为ESI+、MRM方式。在5～500ng/mL范围，基质匹配标准曲线呈线性；平均回收率为71.5%～100%；批内、批间CV均小于10%；LOD为2μg/kg，LOQ为5μg/kg。Jedziniaka等建立了牛肉中安乃近代谢物FAA、AA、AAA和MAA残留的LC-MSMS测定方法。样品用C8色谱柱(150mm×2.1mm，3.5um)分离，流动相为甲醇-乙腈(8+2，v/v)和0.01mol/L甲酸铵溶液(pH5.0)，流速0.3mL/min，梯度洗脱，离子源温度600℃，毛细管电压5.5kV，ESI+、MRM模式检测。实验室内CV为7%～30%；回收率为45%～95%；MAA、FAA、AAA和AA的CCa分别为113μg/kg、11.6μg/kg、11.6ug/kg和12.6μg/kg，CCβ分别为139μg/kg、16.5μg/kg、15.8μg/kg和16.4μg/kg。张崇等建立了羊肌肉组织中安乃近4种主要代谢物(MAA、AA、FAA和AAA)的亲水LC-MS/MS分析方法。肌肉样品均质后，用体积分数为5%的氨水乙腈提取，提取液用Cleanert PSA初步净化，60℃氮气吹干，乙腈复溶后过MAX柱净化，采用亲水LC-MS/MS测定，4种物质均采用外标法定量。在5 μg/kg、50 μg/kg、100μg/kg、1000ug/kg 4个添加浓度，方法回收率在75.02%～116.2%之间，日内CV为1.63%～15.12%，日间CV均小于11%；MAA、FAA和AAA的LOD均为0.5μg/kg，AA为5μg/kg。

沈金灿等还建立了牛奶和奶粉中FAA、AAA、MAA和AA的LC-MS/MS检测方法。采用BEH C18色谱柱分离，流动相为5mmol/L乙酸铵溶液(pH4.5)和甲醇，梯度洗脱，流速0.25mL/min，柱温40℃；ESI+、MRM模式检测，喷雾电压3kV，碰撞气为氩气，辅助气为氮气，辅助气流速750L/h，辅助气温度350℃，离子源温度105℃。FAA、AAA和AA采用外标法定量，MAA采用IAA为内标定量。FAA、AA、AAA、MAA的LOD分别为0.24μg/kg、0.59μg/kg、0.20μg/kg和0.61μg/kg；在添加量5～20μg/kg范围内，4种安乃近代谢物的回收率在80.4%～97.9%之间，RSD均小于9%。

Penney等建立了牛奶、牛肉、猪肉中安乃近及其代谢物残留的测定方法。色谱柱采用Inertsil ODS-3柱，流动相为0.05mmol/L甲酸铵-乙腈，梯度洗脱，流速0.3mL/min，LC-ESI+-MS/MS，MRM模式检测。FAA、AA和MAA的基质匹配标准曲线线性范围为0.02～0.20ug/g，安乃近为0.2～2.0ug/g；牛奶和猪肉中各药物回收率在82%～128%之间，CV均小于11%；FAA、AA和MAA的LOD小于0.02μg/g，安乃近的LOD小于0.13μg/g。

2)酸性药物

保泰松和羟布宗呈酸性，LC-MS检测用负离子模式电离。

Clark等分别采用液相色谱-单极四极杆质谱(LC-MS)和液相色谱-离子阱质谱(LC-MSn)检测牛肾中保泰松残留。色谱柱为YMC ODS-AQ柱(2mm×100mm，3μm)，流动相为乙腈和乙酸铵缓冲液，梯度洗脱。LC-MS测定质谱离子源为ESI、SIM模式检测，脱溶剂气为氮气，流速10L/min，温度200℃，源内电压-165V，雾化气为氮气，气压80psi。在25μg/kg添加浓度，5个样品中有2个满足检测确证阳性条件，另外3个检测信噪比(S/N)小于3。而LC-MSn则采用ESI、MRM模式检测，毛细管电压-3.88kV，毛细管温度350℃，检测灵敏度大于LC-MS，在5～10ppb添加浓度，均可全部检出。

Dubreil-Cheneau等用甲醇提取牛奶中羟布宗、保泰松等12种药物后，直接进LC-MS/MS分析。以C18色谱柱(150mm×2mm，5μm)分离，流动相为1mmol/L乙酸+乙腈(90+10，v/v)和乙腈，梯度洗脱，流速0.4mL/min，三重四极杆质谱以ESI、MRM模式检测。质谱条件：样品管和脱溶剂温度为350℃，毛细管电压4000V，鞘气压力为35任意单位，辅助气压力为10任意单位，离子吹扫气压为25任意单位，碰撞气压1mTorr，驻留时间50ms。方法CCβ为0.5μg/kg，回收率为94.7%～110.0%，CV为2.9%～14.7%。Gentili等采用LC-MS/MS测定牛奶和牛肉中保泰松等15种药物。用XTerra-MS C18(150mm×4.6mm，5μm)色谱柱分离，流动相为乙腈-甲醇(1+1，v/v，含0.2mmol/L二丁胺)和水，梯度洗脱，流速1mL/min，分流比1：9，10%进入三重四极杆质谱分析。离子源为涡轮离子喷雾(Turbo lon Spray)，干燥气和源温度为200℃，负离子源模式，毛细管电压-4500V，MRM模式监测。牛奶中保泰松的CCa和CCβ分别为0.71μg/kg和1.23μg/kg，牛肉中为0.92μg/kg和1.84μg/kg；回收率接近100%。

3)酸性和碱性药物同时检测

本类药物的酸碱性不同，但采用分开进样或电离源正负离子切换方式，可同时测定保泰松、羟布宗、安乃近代谢物等吡唑酮类药物。

Jedziniak等建立了牛奶中保泰松、羟布宗和安乃近4个代谢物等药物的LC-MS/MS同时检测方法。样品经乙腈-乙酸铵缓冲溶液提取，提取液分成两份，一份用于直接测定碱性药物安乃近及其代谢物，另一份经氨基SPE柱净化后，测定酸性药物保泰松和羟布宗。采用Phenomenex Luna C8色谱柱分离，流动相为甲醇-乙腈(8+2，v/v)和0.01 mol/L甲酸铵(pH5.0)，梯度洗脱，流速0.2mL/min，ESI电离，离子源温度600℃，毛细管电压为-5.5kV(负离子模式)和+5.5kV(正离子模式)，MRM模式检测。保泰松和羟布宗为负离子，安乃近代谢物FAA、AA、AAA和MAA为正离子模式。CV为7%～28%，回收率为71%～116%；MAA的CCa和CCβ分别为55ug/kg和61μg/kg，AAA、AA和FAA的CCa和CCβ均在5.2～6.8μg/kg之间，保泰松和羟布宗的CCa和CCβ均在2.7～3.2μg/kg之间，满足残留测定要求。