14.2.1.7 分析条件的选择

(1)安乃近原药的稳定性研究

在安乃近的体内和体外的稳定性研究中，安乃近均被发现容易转化成活性产物4-甲基氨基安替比林。在体内研究中，安乃近被吸收进入血液后，迅速、完全地被代谢为活性产物MAA，再进入体循环，其药理作用主要由MAA产生。在体外研究中，Hakan等最近的研究发现在溶液中安乃近亦容易转化为MAA，影响其降解的主要因素包括浓度、温度和pH。

a.浓度的影响：浓度对于安乃近的降解是--个很重要的因素，通过比较不同浓度的安乃近的降解情况，结果表明在低浓度条件下，安乃近容易迅速降解，而高浓度时则相对稳定；b.温度的影响：温度是另外一个重要因素，通过比较不同温度下安乃近的降解情况，结果表明温度越高，安乃近降解越快；

c.pH的影响：pH对安乃近的降解也影响很大，低pH容易造成安乃近降解。

实验证明了即使是在中性条件、室温条件下，低浓度的安乃近在缓冲溶液中容易迅速转化成MAA。实验将安乃近由甲醇储备液稀释至缓冲溶液中，采用液相色谱-质谱/质谱方法检测不同时间段安乃近的降解程度，结果如图14-5所示。

在2h内安乃近在缓冲溶液中几乎完全降解成MAA。在安乃近原药的加标回收实验中，同样在结果中只检测到了MAA，而安乃近原药没有被发现。由于安乃近原药容易迅速转化为MAA，在安乃近的残留研究中，通常不检测安乃近原药，而是检测其标志性代谢物MAA。为此，本方法没有检测安乃近原药，研究对象为MAA、AA、FAA、AAA及IAA (内标物)。

图14-5 安乃近原药和 MAA的转化

(2)样品前处理条件研究

1)提取缓冲溶液

根据文献报道安乃近及其系列代谢物，易溶于水或甲醇溶液中，其在中性条件下较为稳定，文献报道的提取方法有用有机溶剂(如乙醚)提取，或将样品离心后直接进样测定。本方法在国内外研究的基础上，采用pH7.0的0.1mol/L的Na2SO4作为提取缓冲溶液；由于吡唑类化合物吡唑酮环上的不饱和键易被氧化，故需在溶液中加入一定量的抗氧化剂以避免其被氧化，在本研究中通过在提取溶液中加入20 mmol/L的Na2SO3作为抗氧化剂。

2) SPE柱的选择

实验室比较了HLB、Bond Elut Certify (阳离子和C18混合型SPE柱)、Bond Elute C18的富集和净化效果，结果表明HLB柱对AA的回收率差；BondEluteCertify对MAA的回收率差，而采用BondElut C18富集和净化，各标准物质过柱后的回收率均比较理想(85%以上)，故实验选择Bond Elut C18前处理柱对样品进行富集和净化。

3)色谱柱的选择

比较了Phenomenex Luna C18、Agilent XDB C18及Waters Atlantis dC18色谱柱的分离效果，结果表明，采用常规的色谱柱如Phenomenex Luna C18和Agilent XDB C18反相色谱柱，FAA的保留时间短，峰形差，从而影响检测的灵敏度。而采用Waters的Atlantis dC18柱，由于该类型色谱柱对极性化合物保留较强，从而使得FAA的保留得到增强，同时峰形得到改善，故液质检测时选择Atlantis dC18色谱柱作为分析柱。

4)流动相的选择

质谱采用正离子模式进行检测时，通常需要在溶液中维持一定的酸度以是被分析物容易质子化而带上正电荷，然而pH太低，各组分的保留降低，容易与基质组分共洗脱而使其响应受到抑制。通过实验比较发现，在pH4.5条件下，以5mmol/L的醋酸铵缓冲体系作为流动相各组分得到比较好的分离，并且质谱上有较强的响应，故实验选择pH4.5的5mmol/L的醋酸铵缓冲体系作为流动相。

5)质谱条件的选择

液相色谱法进行定量分析，有时一个色谱峰可能包含几种不同的组分，尤其是复杂样品，成分复杂，样品基质容易对目标物质产生干扰。为了消除干扰，实验采用串联质谱的多反应监测技术(MRM)，这样得到的总离子色谱图进行了3次选择：液相色谱选择组分的保留时间，一级质谱(MS)选择分子量，二级质谱(MS)选择子离子，因此可以尽可能地降低背景基质对谱峰的干扰。然而，样品中的基质效应依然可能对待测化合物的质谱响应产生抑制作用，试验中发现，样品基质对离子化有比较强的抑制作用，不同样品基质对各种安乃近代谢物离子化的抑制情况存在显著差异。为了抵消基质效应的作用，以空白样品提取液作为标准溶液的稀释溶液，可使标准和样品溶液具有同样的离子化条件，从而消除了样品基质效应。

质谱条件的优化：首先采用2.0mg/L的FAA、AAA、AA、MAA和IPA标准溶液在正离子模式下进行母离子全扫描，确定FAA、AA、MAA、DAA和IPA的分子离子分别为m/z232、246、204、218和246，然后分别以这些离子作为母离子，对其子离子进行全扫描。在所用实验条件下，FAA主要产生m/z104.1、83.1、214.2、204.2等子离子；AAA主要产生m/z228.1、104.1、83.1、56.0等子离子；AA主要产生m/z159.1、111.1、104.1、187.1、146.2等子离子；MAA主要产生113.1、111.1、143.1等子离子：IPA主要产生125.1、56.0、153.1、204.1等子离子。选取丰度最强的离子作为各组分的监测离子，优化去簇电压、聚焦电压、射入电压、碰撞电压、碰撞室射出电压、喷雾电压等质谱参数，优化得到的质谱参数为：喷雾电压5.0kV；去簇电压40.0V；聚焦电压200.0V；射入电压10.0V；碰撞室射出电压15.0V；去溶剂温度450℃。

6)定量方式的选择

采用LC-MS-MS对安乃近四种残留物(FAA、AAA、AA和MAA)进行分析时发现，除了AAA和FAA采用外标法进行定量能够得到理想的回收率外，AA和MAA则无法通过外标法进行准确定量。而通过选择IAA作为内标物，对这两种组分进行定量分析，其回收率能够满足残留分析要求。