16.1.4.2 测定方法

生物基质中硝基咪唑类药物的残留分析主要有免疫学方法(IA)、毛细管电泳法(CE)、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)。早期研究集中于单个或几个化合物的分析，现在多残留高通量分析方法得到了较快发展。随着质谱的推广以及该类药物“零残留量”的执行，使得液相色谱-质谱(LC-MS)和气相色谱-质谱(GC-MS)方法成为研究主流。

(1)薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)

TLC系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，根据比移值(Rf)与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值作对比，用以进行药物的鉴别、杂质检查或含量测定。TLC是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术。Meshram等用TLC测定MNZ和咪康唑硝酸盐。固定相使用硅胶(silica gel 60 GF254)，展开剂为甲苯-氯仿-甲醇(3.0+2.0+0.6，v/v)，在240nm波长显像光密度计检测。MNZ、咪康唑硝酸盐的保留因子分别为0.34和0.55；MNZ线性范围为300～700ng/点，咪康唑硝酸盐线性范围600～1400ng/点；采用标准加入法测得MNZ和咪康唑硝酸盐的回收率分别为100.13%±1.59%(点高度)、98.92%±0.76% (点面积)和99.49±1.58% ( 点高度)、99.63%±1.46%(点面积)。但该方法未对组织中残留样品进行测定。高效薄层色谱法(high performance thin layer chromatography，HPTLC)由经典的TLC发展而来，优点是点样量少，分析时间快，分离度和分辨率好，对样品处理要求最低，操作最简便，LOD可达纳克(ng)至皮克(pg)水平。Gaugain等报道了用HPTLC测定猪和家禽组织中DMZ、RNZ、DMZOH残留的方法。固定相为HPTLC级硅胶(10cm×10cm或20cm×10cm)，展开剂为甲醇和乙酸乙酯，先用甲醇洗脱3mm，吹干后再用乙酸乙酯洗脱4min，展开后喷吡啶，紫外光312nm检测。RNZ、DMZ、DMZOH的LOD分别为2μg/kg、4μg/kg、5μg/kg，但未对样品进行定量。

(2)毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)

CE是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的分析方法。在一定的电解质溶液中硝基咪唑类药物都带电荷，带电粒子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移而达到分离。Lin等采用CE测定了猪肉中5种硝基咪唑类药物。分离在未涂层熔融石英毛细管(50cm×50um i.d.)完成，背景电解质采用pH3.0缓冲液(包括25mmol/L磷酸钠-0.1mmol/L溴化四丁胺)，进样时间5s，压力0.5psi，28kV分离电压，选用紫外检测器，在320nm波长检测。方法LOD为1.0ug/kg，LOQ为3.2μg/kg；回收率为85.4%～96.0%，CV为1.3%～3.92%。Hernandez-Mesa等建立了牛奶中硝基咪唑药物及其代谢物的CE分析方法。分离在未涂层熔融石英毛细管(61.5cm×50umi.d.)完成，泡沫细胞毛细管(bubble cell capillary)光通路，长度150um，检测波长320nm，背景电解质为20mmol/L磷酸缓冲液(pH6.5)和150mmol/L SDS混合溶液，温度20℃，25kV正电压。单个样品测定时间小于18min。MNZ、MNZOH、DMZ、RNZ、HMMNI、IPZ、IPZOH、ORZ和TIZ的LOD在0.94～1.8μg/L之间，LOQ为3.13～6.0μg/L，回收率为57%～97.8%。

(3)气相色谱法(gas chromatography，GC)

GC分离测定具有快速、高效的特点，但只是常规分析法，不能确证分析。在硝基咪唑类药物许可使用的时期，GC方法得到一定研究，但随着硝基咪唑类药物的禁用，对检测特异性和灵敏度要求提高，GC方法研究逐渐减少。

RNZ、MNZ、SNZ和ORZ带有羟基，极性较强，热稳定性差，需将羟基通过活泼氢进行硅烷化衍生成极性较弱的衍生物，从而改善挥发性和热稳定性，衍生后增加化合物的分子量，更易于检测。常用的硅烷化试剂主要有N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)和N，O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA)。而衍生化后的硝基咪唑类药物，主要用低极性色谱柱进行分离。Wood测定血液中MNZ时，在氯仿提取物中加入BSTFA过夜后，经GC-火焰离子化检测器(flame ionization detector，FID)检测，色谱柱为3% OV-1柱(183cm×0.04cm)。以肉豆寇醇(myristyl alcohol)为内标，平均回收率为102.9%，LOD为1 ug/mL。Bhatia等建立了测定血液中硝基咪唑类药物GC方法。MNZ、ORZ和SNZ用BSTFA在室温衍生1h，吹干后，用环已烷复溶，进GC-电子俘获检测器(electroncapture detector，ECD)测定。衍生化引入了氟元素，增加了挥发性、灵敏度，减小了色谱柱吸附效应。而TIZ本身含有硫原子，不衍生直接测定，也对ECD敏感。GC色谱柱为3%OV-11玻璃柱(150mm×4mm)。方法回收率为81%～89%，CV小于5%，LOD为100ng/mL。

硝基咪唑类药物结构中含有多个氮原子，沸点较低，提取净化后也可以不衍生直接进行GC-氮磷检测器(nitrogen-phosphorus detector，NPD)检测。Wang等建立了禽肉中DMZ、RNZ和MNZ残留检测的GC-NPD检测方法。样品经乙腈提取后用乙酸酸化，过SCX柱，用乙腈-甲醇(72+28，v/v)洗脱，洗脱液吹干后溶于甲醇，无需衍生直接GC分析。毛细管气相色谱柱为5%二苯基/95%二甲基聚硅氧烷柱(25m×0.32mmi.d，0.52mm)，进样口和检测口温度分别为250℃和300℃，不分流进样，溶剂延迟1.0min，升温程序为：80℃维持1min，以25℃/min升温至173℃，以2℃/min升至185℃，以30℃/min升至260℃，维持3min，氮气为载气，流速1.5mL/min，氮气补充气30mL/min，氢气4mL/min，空气120mL/min，以磷酸三苯酯(triphenylphosphate)为内标定量。DMZ、RNZ和MNZ的回收率分别为85%、90%和80%，CV分别为13.0%、14.3%和11.2%；DMZ和MNZ的LOD为0.2ng/g，RNZ为0.5ng/g。