(2) 提取方法

1)液液萃取(liquid liquid extraction，LLE)

LLE是BMZs残留分析中经常采用的提取方法。由于BMZs以及其代谢物的极性和pK。不同，不仅多种药物同时检测非常困难，而且个别药物及其代谢产物的检测也比较困难。一些研究者采用单一溶剂如乙腈来提取残留物；或者在中性条件下采用水有机溶剂二元溶液来提取BMZs和代谢物；也有少数研究者在需要水解时，或者只检测少数几个代谢物时，采用酸化溶剂提取BMZs和代谢物。常见的提取溶剂有乙酸乙酯、乙腈、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙醚和二氯甲烷等。

乙酸乙酯是采用较多的有机溶剂。Capece等用硼砂-HCl缓冲液调pH至8.0后用乙酸乙酯从肌肉、脂肪和肾组织中提取残留的FBZ。该方法基于将FBZ及其亚砜代谢物氧化成砜代谢物(FBZ-SO2)。提取物无需净化，直接用HPLC测定。在猪肝脏、肌肉、肾脏和脂肪组织中的添加回收率大于69.8%，变异系数(CV)小于15%。 De Ruyck等在碱性条件下( 加入5mL 0.1mol/L NaOH)用乙酸乙酯从鸡蛋和肌肉中提取FLU、FLU-HMET 和FLU-RMET。蒸干提取液，用甲醇-正已烷液液分配净化后，液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)分析。FLU、FLU-HMET和FLU-RMET在鸡蛋和肌肉中的回收率大于70%。该作者测定绵羊肝组织中MBZ的残留标示物。在样品中加入1mL 1mol/L NaOH碱化样品，然后用乙酸乙酯提取MBZ、MBZ-NH2和MBZ-0H。MBZ残留标示物的回收率大于85%。Shaikh等用乙酸乙酯提取三文鱼、罗非鱼和鳟鱼组织中的ABZ、ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2，其回收率分别大于82%、78%、75%和63%。研究发现，提取液中加入DMSO可以提高ABZ回收率；加入偏亚硫酸氢钠能够抑制ABZ-SO氧化为ABZ-SO2，提高ABZ-SO的回收率；使用碳酸钾溶液调pH至9、10和11时，ABZ及其残留标示物的提取效率存在差异但并不显著。Fletouris等发现在pH9.8时，用乙酸乙酯能够很好的从奶样中提取ABZ、ABZ-SO和ABZ-SO2，回收率分别为81%、78%和100%。Alvinerie等在不调节血浆pH的情况下，直接用乙酸乙酯提取TCB、TCB-SO和TCB-SO2。提取液经离心，氮气吹干，复溶后，供HPLC分析。三种化合物的回收率分别为89.5%、83.1%和82.2%，RSD分别为3.1%、3.5%和4.9%，方法检测限(LOD)为50ng/mL。Galtier等用乙酸乙酯提取血浆中的TBZ和TBZ-5-OH，蒸干有机相，残渣溶于流动相采用HPLC分析。Tocco等用0.3mol/L焦磷酸钠将奶样调至pH6.0，用乙酸乙酯提取后转移到0.1mol/L HCI中，用荧光检测器(FLD)检测。在添加浓度为0.1～5μg/g时，TBZ和TBZ-5-OH的回收率为95%±6%。Fletouris等还比较了pH在3～11.5范围内，用乙酸乙酯提取奶样中10种BMZs的效率。发现在pH 10时大多数药物的回收率最好，平均回收率在79%～100%之间，但FBZ的回收率较低，在56%～66%之间；整体RSD在2.0%～5.8%之间。

研究发现乙腈也是有效的动物组织中BMZs的提取溶剂。Fletouris等用乙腈在pH2～9的条件下提取奶中FBZ，回收率均接近100%。试验还表明，用乙腈提取样品时，pH变化对回收率的影响不大。刘洪斌等凹用含5%乙酸的乙腈提取牛奶中的12种BMZs及其代谢物残留，用LC-MS/MS检测，平均回收率在71.4%～101.5%之间，CV小于9.63%。Su等调pH10后用乙腈提取肌肉和肝脏组织中6种BMZs，加入二丁基苯甲醇(BHT)防止TBZ-5-OH氧化，用C18柱净化，HPLC测定。BMZs的LOD在用二极管阵列检测器(DAD)检测时为0.005～0.03mg/kg，用FLD检测时为0.004～0.02mg/kg；回收率在71%～101%之间，日内和日间CV分别为1.92%和7.22%。夏崇菲用pH2.5的柠檬酸缓冲液和乙腈提取猪肉、猪肝、水产品、牛奶和鸡蛋中多种兽药残留物，其中14种BMZs及其代谢物的回收率在60.6%～115.1%之间。

也有采用其他溶液提取BMZs的报道。Brandon等用DMSO-H2O(10+90，v/v)从牛肝脏中提取TBZ，用酶联免疫(ELISA)检测。方法LOD小于20μg/kg，提取回收率可达97%。该作者还建立了一种从肝脏组织中提取FBZ的方法。用DMF-H2O(10+90，v/v)提取样品，增加FBZ的溶解量。加入DMF后，能将FBZ的LOD从640μg/kg降至29μg/kg，但没有说明回收率的变化。Hoaksey等先用乙腈沉淀血浆样品中的蛋白后，再用二氯甲烷提取ABZ和ABZ-SO。提取液用氮气吹干，流动相复溶后，供色谱分析。ABZ和ABZ-SO的平均回收率分别为97%和75%；ABZ的日内、日间CV分别在6.7%～9.5%和5.9～8.9%范围内，ABZ-SO为9.0%～9.4%和7.4%～8.4%。研究发现，尽管用正已烷、乙酸乙酯、乙酸乙酯-正已烷(9+1，v/v)提取ABZ的回收率均大于70%，但是ABZ-SO的回收率均没有超过70%。Bogan等用磷酸缓冲液调节血浆和胃肠液至pH7.4，再用乙醚提取FBZ、OFZ和ABZ残留。提取液用氮气吹干后，用甲醇复溶，HPLC检测，三种药物的添加回收率在70%～103%之间。Blanchflower等用甲醇-水(20+7，v/v)提取肝脏和肌肉组织中的FBZ和OFZ，提取液用石油醚洗涤，经磷酸缓冲液稀释后，再用二乙醚-乙酸乙酯(60+40，v/v)萃取。FBZ和OFZ的回收率分别超过了80%和70%。Kinabo等建立了检测牛奶中TCB及其代谢物的方法。用丙酮提取奶样中的药物，提取液用等量水稀释后，过C18固相萃取柱净化，HPLC测定。对TCB-SO2、TCB-SO和TCB的LOD分别为20μg/L、40μg/L和40μg/L，回收率在76%～92%之间。

2)超临界流体萃取(supercritical fluid extraction，SFE)

SFE是一种将超临界流体作为萃取剂，把一种萃取物从基质中分离出来的技术。二氧化碳(CO2)是最常用的超临界流体。Danaher等用未修饰的超临界CO2(60L，690bar，80℃)从肝脏样品中提取添加的14种BMZs。提取物用中性氧化铝柱和SCX柱净化，再用HPLC检测。除TBZ、CAM和TCB-SO2不能定量外，其余11种BMZs的平均回收率在51%～113%之间。

3)加压溶剂萃取(pressurized liquid extraction，PLE)

PLE也叫加速溶剂萃取(ASE)，是在较高的温度(50～200℃)和压力(1000～3000psi)下，用有机溶剂萃取固体或半固体的自动化方法。提高温度能极大地减弱由范德华力、氢键、目标物分子和样品基质活性位置的偶极吸引所引起的相互作用力。液体的溶解能力远大于气体的溶解能力，因此增加萃取池中的压力使溶剂温度高于其常压下的沸点。该方法的优点是有机溶剂用量少、快速、基质影响小、回收率高和重现性好。Chen等建立了-种测定猪、牛、羊、鸡的肌肉和肝脏中11种BMZs和10种丙硫咪唑、苯硫哒唑和甲苯咪唑代谢物的LC-MS/MS方法。样品处理采用自动化PLE技术，以忆腈/正己烷作为提取溶剂，选用11mL的萃取池对提取条件进行优化，LC-MS/MS检测。添加水平为0.5μg/kg时，回收率为70.1%～92.7%，日间RSDs均低于10%；定量限(LOQ)为0.02～0.5μg/kg。