15.2.2.7分析条件的选择

(1)前处理方法的选择

1)提取溶剂的选择

QCA和MQCA等代谢物在牛奶和奶粉中与蛋白质以结合态存在，通常可采用酸水解、碱水解或酶解的方式将目标化合物与蛋白组织分离，本研究分别采用0.1mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(pH=4)直接均质提取，用甲酸酶解，以及用乙腈+水(1+1，v/v)提取相比较，其中0.1mol/LEDTA-Mcllvaine 缓冲溶液回收率偏低，小于50%；乙腈+水(1+1，v/v)提取则用量比较大，操作繁琐，而且分离效果不是很好；只有酶解的效果最好，不仅反应条件最温和，且与奶制品分离最为彻底。温度和pH对酶的生物活性影响极大，所以本方法选用Protease蛋白酶进行酶解，Protease在pH 8.5、温度47℃时活性最强。酶解之前，先在样品中加0.6%的甲酸溶液，置于47℃空气浴中1h，使牛奶和奶粉中天然存在的酶失活；然后用Tris缓冲溶液调节pH，加入Protease蛋白酶，置于47℃空气浴中过夜16～18h。

2)不同pH比较

本实验比较了在不同pH条件下的净化效果，结果表明，在pH=6～7偏酸性条件下效果最好，相比之下，pH<5和pH>8条件下的回收率都偏低。

3)固相萃取柱选择

在样品溶液中加入0.3mol/L HCI，使酶解液酸化后，采用阴离子交换固相萃取柱进行净化，本研究对比了Bond Elute Certify II 和Oasis MAX两种商用SPE柱的效果，结果表明Bond Elute Certify II在洗脱之后，回收率低于30%，挂柱效果明显较差。而Oasis MAX的净化效果和回收率优于前者，回收率可以达到60%以上。本研究对固相萃取所用溶液、流速控制、淋洗和被测物的洗脱等条件进行优化，根据化合物性质，用含2%甲酸的乙酸乙酯洗脱QCA和MQCA。

15.2.2.8 线性范围和测定低限

在上述确定的仪器检测条件下，取一系列标准溶液(n=8)，以分析化合物和内标化合物的峰面积比为Y轴，以分析化合物和内标化合物的浓度比为X轴作标准曲线，结果表明，2种分析化合物的浓度与峰面积值呈现良好的线性关系，见表15-8。

表15-8 各分析化合物浓度与峰面积的线性关系

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