18.1.4.2 测定方法

目前有关动物源基质中左旋咪唑的残留检测方法主要有快速检测法和仪器检测方法。快速检测方法主要为生物传感器法，仪器方法主要包括气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱联用法(LC-MS)等。

(1) 生物传感器法(biosensor)

生物传感器是以固定化的生物成分(如酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原)或生物体本身为敏感材料，与适当的化学换能器相结合，用于快速检测物理、化学、生物量的新型器件。与其他方法相比，其精密度高，可做到小型化、自动化、方便现场检测。Crooks等报道了采用免疫生物传感器测定牛肝脏和奶中左旋咪唑残留的检测方法。将左旋咪唑衍生为氨基左旋咪唑，并连接牛血清载体蛋白，制得纯化抗原，并用其来制备兔多克隆抗体。将药物衍生物固定在CM5传感器芯片上，抗体可结合在传感器芯片表面，从而得到检测。反应物在芯片表面能够稳定再生几百次，单个分析过程(包括加样、芯片再生和系统清洗)只需要6min就能完成。样品采用乙腈提取，肝脏样品需要额外的过滤，采用Biacore生物传感器检测。肝脏组织的LOD为6.8μg/kg，牛奶为0.5μg/L；肝脏在100μg/kg添加水平的CV为6.7%，牛奶在2μg/L添加水平的CV为2.4%。McGarrity等开发了基于竞争性化学发光免疫分析的生物芯片阵列试剂盒用于左旋咪唑等20多种驱虫药物的筛选检测。固体支持物和容器中的生物芯片包含的离散点的阵列，该法适用于半自动台式分析仪。左旋咪唑的LOD为2μg/L(牛奶)、6.5μg/kg(组织)；方法回收率在71%～135%之间。

(2)电化学发光分析法(electrochemiluminescence)

电化学发光分析法具有灵敏度高、仪器设备简单、操作方便、易于实现自动化等特点，广泛地应用于生物、医学、药学、临床、环境、食品、免疫和核酸杂交分析和工业分析等领域。Xiao等开发了血清中左旋咪唑的电化学发光检测方法。该方法基于由Ru(bpy)3 2+引导的电化学发光信号增强，在12mmol/L的硼酸缓冲液(pH9)中，该离子在铂电极.上与左旋咪唑的叔胺基团反应。发光强度和左旋咪唑的浓度在0～1×10-7 mol/L之间呈良好线性，方法LOD为1.76×10-11 mol/L。

(3)气相色谱法(gas chromatography，GC)

GC具有操作简单、分析速度快、高效能、高选择性、高灵敏度、分析速度快和应用广泛等优点。目前国内已有采用GC检测动物组织中左旋咪唑残留量的报道。

张丛兰建立了猪、鸡、羊可食用组织中左旋咪唑残留的GC检测方法。取匀质样品，KOH溶液碱化，乙酸乙酯提取，盐酸溶液反萃取，KOH溶液中和酸，再用三氯甲烷萃取，取三氯甲烷层进：样分析。采用HP-6890气相色谱仪，氮磷检测器(NPD)，HP-5毛细管柱(30m×0.32mm)分离，氮气为载气，流速2mL/min。结果显示，在0.05～3.2μg/mL时，浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数R为0.9996；各组织中左旋咪唑的LOD为5μg/kg；在添加浓度为5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg时，各组织的回收率分别为：肌肉大于83.1%，肝脏大于81.4%，脂肪大于70.9%，肾脏大于81.8%；日内、日间CV均小于12.5%。Casale等通过采用手性毛细管柱，开发了GC-火焰离子化检测器(FID)测定尿中左旋咪唑/右旋咪唑对映体的方法。

(4)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC是兽药残留定量、定性分析的有效手段，具有检测灵敏度高、选择性好、定性定量同时进行、结果可靠等优点。目前，动物源基质中左旋咪唑残留检测方法报道最多的就是HPLC方法，常用的检测：器有紫外检测器(UVD)和二极管阵列检测器( PDA/DAD)等。

曾勇等建立了猪、鸡组织中左旋咪唑残留的HPLC-UVD检测方法。样液经混合型阳离子固相萃取小柱净化后，采用Agilent TC-C18(5um，250mm×4.6mm i.d.)色谱柱分离，流动相由0.02mol/L磷酸二氢钠-二乙胺缓冲液和乙腈按体积比7：3比例配制，HPLC在220nm波长处测定，外标法定量。左旋咪唑的保留时间为12～13min；在10～1000μg/L时，浓度与峰面积呈良好的线性关系，r为0.9999；在肌肉、脂肪和肾脏中的LOD为2μg/kg，LOQ为5ug/kg；在肝脏中LOD为2μg/kg，LOQ为10μg/kg；在不同添加浓度水平下，平均回收率在70%～110%之间，批内CV在10%以内，批间CV在15%以内。Tyrpenou等建立了绵羊肌肉组织中左旋咪唑残留的HPLC-PDA检测方法。采用乙酸乙酯提取并LLP净化，氢氧化钾碱性溶液条件下再用氯仿二次提取。采用Zarbax SB-C18色谱柱
分离，柱温50℃，流动相为体积分数0.1%的三氟乙酸(pH2.0)和乙腈-甲醇(3+2，v/v)按体积比30：70的比例配制而成，流速为1.0mL/min，检测波长为220nm。在1/2倍、1倍、2倍和4倍MRL添加浓度的平均回收率为75.65%±2.74%，CV为10.4%；LOD和LOQ分别为2.0ug/kg和5.0μg/kg。

用该方法测定肾脏、肝脏和脂肪组织中左旋咪唑残留，平均回收率分别为70.25%±1.07%、72.37%±3.6%和69.44%+2.22%，CV分别为1.52%、4.97%和3.19%。坂本美穗等也建立了畜产品中左旋咪唑残留的HPLC检测方法。用碱性乙酸乙酯提取牛、猪、禽的肌肉、肝、肾和脂肪组织中的左旋咪唑，并用0.1mol/L盐酸溶液反萃取，提取液采用SCX柱净化，HPLC检测。色谱柱为ODS-80Ts(4.6mm×150mm，5um)，流动相为0.02mol/L KH2PO4-二乙胺(299+1，v/v，pH7.5)与乙腈按体积比7：3混合，流速1.0mL/min，柱温40℃，PDA检测波长220nm，进样量20uL。该方法LOD为5μg/kg，平均回收率在78.3%～99.8%之间。

林维宣等建立了牛乳中左旋咪唑残留量的HPLC测定方法。采用Spherisorh C18 色谱柱分离，流动相由甲醇、0.05mol/L磷酸缓冲液、二乙胺按体积比70：30：1比例配制而成，流速0.8mL/min，UVD在230nm处检测，外标法定量。该方法LOD为10ug/kg；在添加10ug/kg、50μg/kg、2000μg/kg时，方法回收率为80.1%～84.2%，CV为7.2%～9.6%。De Ruyck等建立了牛奶中左旋咪唑等驱虫药残留的HPLC检测方法。采用离子对液相色谱，色谱柱为Alltimna C18(5um， 150mm×3.2 mm i.d.)，以0.01 mol/L 1-辛烷磺酸钠离子对试剂(正磷酸调pH3.0)-甲醇-水为流动相，梯度洗脱，DAD检测，左旋咪唑检测波长为225nm。该方法平均回收率在68%～85%之间，左旋咪唑LOD为0.5μg/L，LOQ为1.4μg/L，CV为12.7%。

El-Kholy等建立了测定鸡蛋和d血浆中左旋咪唑的HPLC-UVD检测方法。以Luna8 C18(150mm×4.6mm i.d，5μm)作为色谱分离柱，2%乙酸水溶液-甲醇(50+50，v/v)作为流动相，同时加入低UV反应的庚烷磺酸钠(Pic-B7)离子对化合物，并用氢氧化铵调节pH7.31，流速为1.0mL/min，波长225nm处检测，以甲基左旋咪唑作为内标定量。该方法的LOD均为1μg/kg(L)；血浆的LOQ为3ug/L，其他组织为25μg/kg。Chiadmi等报道了血浆中左旋咪唑的HPLC分析方法。采用C18色谱柱分离，磷酸盐缓冲液-乙腈溶液等度洗脱，DAD在235nm测定。该方法在50～2000ng/mL范围呈良好线性，LOQ为28ng/mL，日内和日间CV均小于7%。