5.操作步骤

　　(1)样品提取称取2g(精确至0.01g)试样于50mL具塞塑料离心管中，加入15mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min后，以不低于4000r/min离心10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL滤液，加入5mL水混匀后作待净化液。

　　注：若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化。

　　(2)样品净化固相萃取柱中事先加入3mL甲醇和3mL水通过小柱调整，流出液弃去，然后加入稀释后的待净化液，待全部样品经过小柱后，再依次用3mL水和3mL甲醇洗涤固相萃取柱，抽至近干后，向固相萃取柱中加入6mL氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物(相当于0.4g样品)用1mL流动相定容，旋涡混合1min，过微孔滤膜后，供测定。

　　(3)液相色谱仪测定

　　①仪器条件

　　色谱柱：C8柱，250mm×4.6mm(i.d.)，5um，或相当者;C18柱，250mm×4.6mm(i.d.)，5um，或相当者。流动相：C8柱，离子对试剂缓冲液-乙腈(85+15，体积比)，混匀;C18柱，离子对试剂缓冲液-乙腈(90+10，体积比)，混匀。流速：1.0mL/min;柱温：40℃;测定波长：240nm;进样量：20uL。

　　②标准线性：用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.8，2，20，40，80ug/mL的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。

　　③定量测定：待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。

　　6.结果计算

　　试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按下式计算获得。

　　式中x——试样中三聚氰胺的含量，mg/kg

　　A——样液中三聚氰胺的峰面积，cm2

　　p——标准溶液中三聚氰胺的浓度，ug/mL

　　V——样液最终定容体积，mL

　　As——标准溶液中三聚氰胺的峰面积，cm2

　　m——试样的质量，g

　　f——稀释倍数

　　7.要点提示

　　(1)固相萃取柱流速不可过快，否则影响净化效果，一般控制在1～2滴/s为宜。

　　(2)必要时应添加回收质控样品以监控检测质量，一般控制回收率在80%～120%为宜，阳性样品应使用回收率校正后报告结果。

　　(3)C18、C8色谱柱属于反相柱，柱管内充满有机溶剂，检测样品前，应用10倍柱体积的流动相冲洗色谱柱;检测完毕后，使用乙腈-水(20+80)的流动相以1mL/min的流速冲洗色谱柱20～30min，再用10～20倍柱体积的甲醇或乙腈将柱管内的流动相置换出来，使其保存在有机相中以保证其可靠的色谱性能。