苏丹红的检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱联用法、薄层层析法等。在此介绍高效液相色谱法(依据《GB/T19681-2005食品中苏丹红染料的检测方法》)。

　　1.原理

　　样品经溶剂提取、固相萃取净化后，用反相高效液相色谱紫外可见光检测器进行色谱分析，采用外标法定量。

　　2.试剂

　　(1)乙腈：色谱纯。

　　(2)丙酮：色谱纯、分析纯。

　　(3)甲酸：分析纯。

　　(4)乙醚：分析纯。

　　(5)正已烷：分析纯。

　　(6)无水硫酸钠：分析纯。

　　(7)层析柱管：1cm(内径)×5cm(高)的注射器管。

　　(8)层析用氧化铝(中性100～200目)：105℃干燥2h，于干燥器中冷却至室温，每100g中加入2mL水降活，混匀后密封，放置12h后使用。

　　(9)氧化铝层析柱：在层析柱底部塞入一薄层脱脂棉，干法装入处理过的氧化铝至3cm高，轻轻压实后加一薄层脱脂棉，用10mL正己烷预淋洗，洗净柱中杂质后，备用。

　　(10)5%丙酮的正己烷液：吸取50mL丙酮用正己烷定容至1L。

　　(11)标准物质：苏丹红I、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ;纯度≥95%。

　　(12)标准储备液：分别称取苏丹红I、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ及苏丹红Ⅳ各10.0mg(按实际含量折算)，用乙醚溶解后用正己烷定容至250mL。

　　3.仪器

　　(1)高效液相色谱仪(配有紫外可见光检测器)。

　　(2)分析天平：感量0.1mg。

　　(3)旋转蒸发仪。

　　(4)均质机。

　　(5)离心机。

　　(6)0.45um有机滤膜。

　　4.操作步骤(以红辣椒粉等粉状样品为例)

　　(1)前处理称取1～5g(准确至0.001g)样品于三角瓶中，加入10mL到30mL正己烷，超声5min，过滤，用10mL正已烷洗涤残渣数次，至洗出液无色，合并正己烷液，用旋转蒸发仪浓缩至5mL以下，慢慢倒入氧化铝层析柱中，为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左右上样，在全程的层析过程中不应使柱干涸，用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入柱中。控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于0.5cm，待样液完全流出后，视样品中含油类杂质的多少用10～30mL正己烷洗柱，直至流出液无色，弃去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己烷液60mL洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5mL，经0.45um有机滤膜过滤后待测。

　　(2)测定

　　①推荐色谱条件：

　　色谱柱：ZotbaxSB-C18 3.5um 4.6mm×150mm(或相当型号色谱柱);流动相：溶剂A0.1%甲酸的水溶液：乙腈=85：15，溶剂B 0.1%甲酸的乙腈溶液：丙酮=80：20;梯度洗脱条件：见表6-8;柱温：30℃;检测波长：苏丹红1478nm;苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ520nm;于苏丹红I出峰后切换。

　　表6-8梯度洗脱条件

　　②标准曲线：吸取标准储备液0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6mL，用正已烷定容至25mL，此标准系列浓度为0，0.16，0.32，0.64，1.28，2.56ug/mL，各进样量10uL，绘制标准曲线。

　　5.结果计算

　　式中X——样品中苏丹红含量，mg/kg

　　p——由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度，ug/mL

　　V——样液定容体积，mL

　　m——样品质量，g