(7)色-质联用分析法(chromatography-mass spectrometry analysis)

将色谱的高分离能力与质谱的定性能力结合起来，组成的联用分析技术，不仅可以取长补短，起到方法间的协同作用，提高方法的灵敏度、准确度以及对复杂混合物的分辨能力，同时还能获得两种手段各自单独使用时所不具备的某些功能。应用于β-受体激动剂残留分析的主要是气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)以及毛细管电泳-质谱法(CE-MS)。

1)气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)

GC-MS是β-受体激动剂残留检测中使用最多的分析方法，具有很高的特异性，能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性和定量分析。

Solans 等采用GC-MS分析尿样中β-受体激动剂的残留情况。样品经β-葡萄糖醛酸酶芳基硫酸酯酶水解后，用Bond-Elut Certify提取，β-受体激动剂通过 N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)衍生后，再由GC-MS在全扫描(Scan)模式下分析，选择离子监测(SIM)模式定量。朱坚等到对GC-MS同时测定肝、肾和肉中11种β-受体激动剂残留的方法进行了研究。样品经pH5.2的乙酸钠缓冲溶液提取，提取液用β-盐酸葡萄糖醛苷酶芳基硫酸酯酶水解，用高氯酸沉淀蛋白质，经异丙醇乙酸乙酯(6+4，v/v)液液分配，再经阳离子交换树脂(SCX)小柱净化后，用BSTFA衍生化，以美托洛尔为内标，GC-MS在电子轰击(El)电离源、SIM模式下检测。方法回收率为71%～94%，CV为4.6%～18.7%，最低检测限为0.002～0.0005mg/kg。孟娟等采用类似的技术测定了动物组织中克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布它林、喷布特罗、心得安、倍他索洛尔、非诺特罗等8种β-受体激动剂的残留量。GC-MS在EI电离源、SIM模式下检测，方法回收率范围为51.9%～101.7%，RSD为2.7%～16.0%。田苗建立了猪肉、猪肝、猪肾中10种β-受体激动剂残留量的检测方法。样品经乙酸钠缓冲溶液提取后，依次经液液萃取、阳离子交换柱净化，再经BSTFA-三甲基氯硅烷(TMCS)(99+1，v/v)衍生，GC-MS检测。该方法线性关系良好，相关系数2大于0.996，检出限为1～5ug/kg；对猪组织样品的室内平均回收率为59%～77%，RSD为0.87%～7.0%，室间平均回收率为63%～76%，RSD为1.5%～12.6%。
Amendola等国采用气相色谱-离子阱质谱(GC-MSn)分析尿样中克伦特罗的残留情况。克伦特罗衍生物用EI源电离，通过三级质谱得到了充分的结构信息。MS1为m/z 335～337，MS2为m/z 300，但在四级质谱中没有发现进一步确证的结构信息，并且没有提高信噪比。MS3的灵敏度优于0.2ug/L，线性范围在0.5～5ug/L之间。作者认为，与GC-MS和气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)相比，GC-MS3也是β-受体激动剂确证检测的良好手段。

Batjoens等采用GC-MS对动物粪便中β-受体激动剂的残留情况进行分析。通过不同的离子化模式(EI、Cl)、不同的衍生化方法以及串联质谱比较研究，获得了大量的质谱信息。在El电离方式下，部分β-受体激动剂TMS衍生物的质谱断裂途径参见图1-3。

图1-3部分 β-受体激动剂TMS衍生物的EI断裂途径

2)液相色谱-质谱联用法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)

HPLC方法由于检测器选择性的限制，导致灵敏度相对较低。但随着电喷雾(ESI)接口技术的成熟，使LC-MS在β-受体激动剂分析领域迅速得到发展。同时，由于串联质谱技术(MS/MS)的出现，质谱检测器的选择性和灵敏度得到了进一步的提升，定性同时进行定量，使得LC-MS在β-受体激动剂检测领域得到普及，并逐步取代GC-MS成为应用最为广泛的现代分析技术。

Caloni等采用LC-MS技术对经ELISA试剂盒筛选的代乳制品中阳性结果进行了复核，可以同时确证沙丁胺醇、马布特罗、克伦特罗和特布它林。马布特罗、克伦特罗和特布它林的检测低限为250ng/mL，沙丁胺醇为2.5ug/L，方法回收率为84%～90.2%。

刘畅等建立了动物源性食品中15种β-受体激动剂残留的LC-MS/MS检测方法。选用β-盐酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酯酶水解，PCX柱净化，以乙腈-甲醇-0.4%甲酸(30+4+66，v/v)作为流动相，LC-MS/MS检测。采用外标法定量，15种β-受体激动剂的平均回收率为54.0%～98.9%，最低检出浓度为0.04～0.33ug/kg。Liu等利用LC-MS/MS技术，在ESI正离子、多反应监测(MRM)模式下，建立了猪肝和猪肉中20种β-受体激动剂的测定方法。为减小基质效应的影响，采用基质添加标准曲线定量，CCa为0.05～0.23 ug/kg(猪肉)、0.05～0.57 ug/kg(猪肝)，CCβ为0.11～0.4ug/kg(猪肉)、0.16～0.79ug/kg(猪肝)。孙志文等利用LC-MS/MS测定了猪肌肉组织中苯乙醇胺A的残留量。色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1mm×50mm，1.7um)，流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液(30+70，v/v)，流速0.3mL/min，在ESI正离子模式下，采用MRM模式检测。方法检测限为0.2ug/kg。

王娟等建立了LC-MS/MS同时检测牛奶中10种β-受体激动剂残留量的方法。样品经沉淀蛋白质，酸性水溶液提取，MCX固相萃取柱净化，LC-MS/MS方法测定。采用Thermo Hypersil Gold(150mm×2.1mm，5um)色谱柱分离，5mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇为流动相，梯度洗脱。方法线性相关系数r均大于0.999；克伦特罗LOD为1.68ug/kg，其余9种β-受体激动剂在0.146～0.203ug/kg之间；克伦特罗LOQ为3.37ug/kg，其余9种在0.290～0.407ug/kg之间；3个添加水平下，10种β-受体激动剂平均回收率在91%～127%之间。聂建荣等]建立动物尿液中15种β-受体激动剂的LC-ESI-MS/MS同时分析方法。样品用高氯酸溶液酸解及沉淀蛋白质，经HLB固相萃取小柱净化、富集后，以甲醇和0.1%甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，采用MRM模式进行定性和定量分析。15种β-受体激动剂在0.25～20μg/L的范围内线性关系良好(r≥0.9995)；在0.25ug/L、1.0ug/L、10μg/L添加水平下，方法回收率为62.1%～107%，RSD为3.5%～9.9%；LOQ为0.25μg/L。

Fan等的应用高效液相色谱-线性离子阱质谱(HPLC-LIT-MS)法建立了同时测定动物源食品中25种β-受体激动剂残留的分析方法。样品水解后用5%三氯乙酸提取，然后用MCX柱结合甲醇进行净化。以甲醇和0.1%甲酸水作为梯度洗脱的流动相，Supelco Ascentis Express RP-酰胺柱进行LC分离后，在ESI+、多重反应监测(CRM)模式下进行测定，将由氟标记的9种β-受体激动剂作内标进行定量。分析物的线性范围为5～200ug/L，线性相关系数大于或等于0.995；添加回收率在46.6%～118.9%之间，RSD为1.9%～28.2%；方法CCa和CCβ范围分别为0.05～0.49 μg/kg和0.13～1.64ug/kg。

在LC-ESI-MS分析中，β-受体激动剂的断裂途径参见图1-4。

图1-4 β 受体激动剂ES1质谱断裂途径

3)毛细管电泳-质谱法(capillary electrophoresis-mass spectrometry，CE-MS)毛细管电泳-质谱技术(CE-MS)在β-受体激动剂的分析中应用较少。

Anurukvorakun等采用非水毛细管电泳-质谱(NACE-MS)技术建立了猪肉中痕量β-受体激动剂(克伦特罗、沙丁胺醇、特布特罗等)的测定方法。NACE采用甲醇-乙-冰醋酸(66+33+1，v/v，含18mmol/L乙酸铵)缓冲溶液，电压28kV，飞行时间质谱(TOF-MS)采用甲醇-水(80+20，v/v含5mmol/L乙酸铵)为鞘液，水动力和电动力联合进样，提高了方法灵敏度。该方法对所有分析物的检测限均为0.3ppb，线性范围为0.8～1000ppb，相关系数大于0.999，方法回收率为69%～80%，RSD小于17.7%。通过与LC-MS/MS方法进行比较验证，没有发现统计学差异。van der Vlis等建立了一种在线液液电萃取-等速电泳-毛细管区带电泳-电喷雾质谱(EE-ITP-CZE-ESP-MS)方法分析盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、特布它林和非诺特罗。在高电场力作用下，通过液液萃取快速将离子化的β-受体激动剂从低导电率的有机溶剂萃取到一个小体积的缓冲溶液中，而ITP使分析物远离液-液界面，再经毛细管区带电泳-电喷雾质谱测定。盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和特布它林的检测限可达到2×10-9 mol/L，非诺特罗为5×10-9mol/L。