5.2.2.7分析条件的选择

(1)沉淀剂的选择

在本方法的研究中,根据牛奶和奶粉中蛋白质含量高的特点,首先要选择合适的沉淀剂去除蛋白，从而减小或去除对测定的干扰。分别用乙腈、三氯乙酸、乌酸钠、复合沉淀剂1：Carrez I (0.36mol/L K4Fe(CN)6·3H2O)和CarrezII (1.04mol/L ZnSO4·7H2O)、复合沉淀剂2：(1.5%五磺基水杨酸、85%甲醇和25%蒸馏水)。实验发现，用三氯乙酸、乌酸钠和复合沉淀剂 2 的沉淀效果不好，溶液浑浊，离心也不能使其澄清，对测定的干扰比较大。用乙腈、复合沉淀剂1(各150μL)的沉淀效果好，离心后的上清液非常澄清，但无论是用乙腈、甲醇、磷酸盐缓冲液以及乙腈-水的混合液做提取液，9种青霉素的回收率普遍较低，尤其是阿莫西林和安苄西林回收率均低于50%。所以实验选择用乙腈来沉淀蛋白。

(2)提取液的选择

分别用磷酸二氢钠溶液、用不同体积比乙腈～磷酸二氢钠溶液(0.05mol/L，pH8.5)(5+2，v/v)、乙腈、用不同体积比的乙腈-水作为提取液，做添加回收率试验。实验发现，当用磷酸二氢钠缓冲液作为提取液不能沉淀蛋白，过固相萃取柱比较困难。用不同体积比乙腈-磷酸二氢钠溶液(0.05mol/L，pH8.5)做提取液时，9种青霉素的回收率均不高。用乙腈做提取剂时，阿莫西林和氨苄西林回收率较低。用不同体积比乙腈-水做提取剂时，发现乙腈体积比大，易于青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、双氯西林提取，而阿莫西林和氨苄西林较低，而水的体积比大利于阿莫西林和氨苄西林的提取，对氯唑西林、萘夫西林、双氯西林提取率较低。所以配制不同比例的乙腈-水溶液作为提取剂，乙腈-水的比例为1：1.2：1.3：1、4：1、5：1。实验发现当乙腈-水比例为3：1时，9种青霉素的回收率均较高，且蛋白沉淀较好，所以实验选择乙腈-水(3+1，v/v)作为提取剂。

(3)固相萃取柱的选择

在本方法的实验过程中，先后使用了BUNDELUT C18固相萃取柱(3cm3和6cm3)、OasisHLB固相萃取柱(3cm3和6cm3)。结果发现C18柱两种规格对阿莫西林的保留均不完全，OasisHLB固相萃取柱(3cm3和6cm3)对9种青霉素的保留较好，3cm3 HLB柱过柱较慢，流速不好控制。6cm3 HLB固相萃取柱的净化效果最好，柱体不容易堵塞，回收率稳定，故选择6cm3 HLB固相萃取柱为净化柱。在洗脱剂的选择上，3mL乙腈能将其完全洗脱，但许多杂质也被淋洗下来。实验了不同比例的乙腈-水溶液作洗脱液，结果发现已腈-水(1+1，v/v)4mL便能将9种青霉素完全淋洗下来(如图5-5所示)，这样降低了洗脱强度，减少了洗脱液中的杂质，降低了对分析物测定的干扰。

图5-59 种青霉素的洗脱曲线

(4)液相色谱分析柱的选择

实验采用了0.1%乙酸-乙腈做流动相，采用时间梯度洗脱，在150 mm×2.1 mm (i.d.), 填料颗粒直径4.6 um的苯基柱分离待测组分，分析物在最大程度上得到了分离，且峰对称尖锐，加之质谱的高选择性，通过MRM色谱图能够较好的定性定量9种分析物，无内源干扰物影响组分的测定。