5.2.6.6 测定

(1)液相色谱条件

色谱柱：ZORBAXSB-C18，3.5um，150mm×2.1mm(内径)或相当者；流动相组成、流速及梯度程序见表5-35；柱温：30℃；进样量：20uL。

(2)质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；电喷雾电压：5500V；雾化气压力：0.055MPa；气帘气压力：0.079MPa；辅助气流速：6L/min；离子源温度：400℃；定性离子对、定量离子对和去簇电压(DP)、碰撞气能量(CE)见表5-36。

(3)定性测定

选择每种待测物质的一个母离子，两个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间，与基质标准溶液中对应物质的保留时间偏差在±2.5%之内；样品谱图中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标准溶液的谱图中离子相对丰度相比，偏差不超过表1-5规定的范围，则可判定为样.品中存在对应的待测物。

(4)定量测定

用空白样品添加标准混合工作溶液分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中5种头孢菌素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，5种头孢菌素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图见图5-6。

5.2.6.7 分析条件的选择

(1)提取溶液的选择

在本方法的研究中，根据河豚鱼和鳗鱼样品的特点和被测物的性质，利用乙腈具有脱蛋白质的作用，本方法采用乙腈作为提取液，消除基质对5种头孢菌素的干扰。分别完成河豚鱼、鳗鱼中5种头孢菌素用乙腈提取不同次数回收率实验，详见表5-44和表5-45。实验发现，当两种样品用乙腈提取一次时，5种头孢菌素的回收率范围为80.6%～87.5%；用乙腈提取两次，5种头孢菌素的回收率范围为96.7%～101.4%，满足工作要求，因此，本方法使用乙腈作为提取液。

表5-44 鳗鱼样品用乙腈提取5种头孢菌素的回收率

表5-45 河豚鱼样品用乙腈提取5种头孢菌素的回收率

(2)液相色谱分析柱的选择

分别使用μBondapak C18 300mm×4.0mm色谱柱和ZORBAXSB-C18 3.5μm 150mm×2.1mm色谱柱对5种头孢菌素的色谱行为进行了比较。实验发现，这两种色谱柱的灵敏度均能满足要求，但uBondapak C18 300mm×4.0mm色谱柱流速在1.5mL/min，进质谱仪之前必须分流，而分流时对5种头孢菌素结果的测定产生一定误差，而使用ZORBAXSB-C18 3.5um 150mm×2.1mm柱不需分流，定量准确度优于uBondapak C18柱，通过以上对两种色谱柱的比较，本方法选用ZORBAXSB-C18 3.5um150mm×2.1mm为5种头孢菌素的分析柱。

5.2.6.8 线性范围和测定低限

配制含头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟、头孢唑啉浓度分别为2.5～200ng/mL、2.5～200ng/mL、2.5～200ng/mL、2.5～200ng/mL、12.5～1000ng/mL的样品基质混合标准溶液(0.5～40 LOD)，在选定的条件下进行测定，进样量为20uL，用峰面积对标准溶液中各被测组分的浓度作图，头孢唑啉、头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟的绝对量分别在0.05～40ng范围内均呈线性关系，符合定量要求，其线性方程和校正因子见表5-40。

在该方法操作条件下，5种头孢菌素在添加水平2～100μg/kg(LOD～10 LOD)范围时，各自的测定响应值在仪器线性范围之内。同时，样品中头孢唑啉的添加浓度为10ug/kg；头孢匹林的添加浓度为2.0ug/kg；头孢氨苄的添加浓度为2.0ug/kg；头孢洛宁的添加浓度为2.0ug/kg；头孢喹肟的添加浓度为2.0μg/kg时，所测谱图的信噪比远大于10。因此，确定本方法的检出限头孢唑啉为10ug/kg；头孢匹林为2.0μg/kg；头孢氨苄为2.0ug/kg；头孢洛宁为2.0ug/kg；头孢喹肟为2.0μg/kg。