(2) 净化方法

硫脲嘧啶类药物传统的净化方法主要包括液液分配(LLP)、固相萃取(SPE)、基质固相萃取(MSPD)和凝胶渗透色谱(GPC)等。

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

液液分配净化方法主要是通过调节pH，使分析物在水相-有机相中分配，或根据硫脲嘧啶类药物化学极性的特点，采用非极性的正己烷或石油醚液液分配去除非极性杂质。

Le Bizec等采用0.1mol/L氢氧化钠提取甲状腺中6种硫脲嘧啶类药物，经五氟溴化苄(PFBBr)衍生化后，用冰乙酸调至pH3，再加入二氯甲烷LLP，取有机相进一步净化和甲酯化衍生后，GC-MS检测，方法回收率在40%～70%之间。Pinel等采用甲醇提取冻干组织(肌肉、肝脏和甲状腺)中的8种硫脲嘧啶类药物，提取液氮气吹干后，用pH8磷酸盐缓冲液溶解，衍生化，用35% HCL调节pH2～3后，再用乙醚LLP提取净化，进-步用SPE净化后，用LC-MS/MS测定。该方法CCa为0.1～5.2ug/L，CCβ为2.6～23.2ug/L。Yu等采用乙腈提取牛肉中的4种硫脲嘧啶类药物，乙腈提取液用正已烷LLP净化去除脂肪，再用SPE净化和衍生化后用GC-MS测定。该方法回收率在50%～90%之间，CV小于10%。

2)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

SPE是硫脲嘧啶类药物残留分析中运用最为广泛和有效的净化方法。最早采用的是汞化树脂净化方法，巯基可以被汞有效吸附，而在SPE柱上保留。但汞化树脂对巯基苯并咪唑和苯基硫脲嘧啶的回收率不好，可能是由于结构中含有苯环，与树脂中的芳环相互作用，使保留增强。

采用最多的SPE柱是硅胶柱。Blanchflower等用乙酸乙酯提取甲状腺中的5种硫脲嘧啶类药物，提取液氮气吹干后，用氯仿溶解，过氯仿平衡后的Sep-Pak硅胶SPE柱，氯仿洗涤，甲醇-氯仿(15+85，v/v)洗脱，洗脱液氮气吹干，用25%甲醇溶解后，LC-MS检测。该方法添加回收率在48.1%～95.8%之间，检测灵敏度在25ng/g左右。Pinel等采用硅胶柱对肌肉、肝脏和甲状腺中8种硫脲嘧啶类药物的3IBBr衍生物进行净化。衍生产物用二氯甲烷环已烷(1+3，v/v)溶解，硅胶柱用环已烷平衡，上样后用环已烷洗涤，正已烷-乙酸乙酯(40+60，v/v)洗脱，洗脱液氮气吹干后用流动相溶解，LC-MS/MS测定，方法CCa为0.1～5.2ug/L，CCβ为2.6～23.2μg/L。Abuin等用甲醇提取甲状腺中的苯基硫脲嘧啶和硫脲嘧啶，氮气吹干后，用600μL二氯甲烷～环已烷(1+1，v/v)溶解，过已用环己烷平衡的硅胶柱净化，5mL环己烷淋洗，5mL环己烷-乙酸乙酯(4+6，v/v)洗脱，洗脱液吹干后用去离子水复溶，超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测定。方法回收率在40%～79%之间；CCa为4.3～16.1ug/kg，CCβ为8.7～20.7ug/kg；RSD在5.6%～10.3%之间。

Guzman等采用甲醇提取饲料中的甲基硫脲嘧啶、硫脲嘧啶和苯基硫脲嘧啶，过已用甲醇洗涤的Florisil固相萃取柱净化，接收流出液，对豌豆粉样品还要在SPE柱上加1.7g无水Na2SO4去除水分，再使用流动注射-碳纤维微电极安培检测器检测。方法回收率高于80%，甲基硫脲嘧啶的LOD为2.6×10-7 mol/L。

根据硫脲嘧啶类药物极性强的特点，采用正相SPE柱可以对分析物有效保留，但反相SPE柱同样可以达到净化的目的。对组织和饲料样品，Pinel等在硅胶柱净化前先用C18固相萃取柱净化。衍生产物用甲醇-水(10+90，v/v)溶解，C18固相萃取柱依次用甲醇、水平衡，上样后，用甲醇-水(50+50，v/v)洗涤，甲醇-水(90+10，v/v)洗脱，洗脱液氮气吹去甲醇后，用35% HCL调节pH2～3后，再用乙醚LLP提取净化，进一步用硅胶SPE柱净化后，用LC-MS/MS测定，方法CCu为0.1～5.2μg/L，CCβ为2.6～23.2μg/L。我国国家标准GB/T21310-2007采用Oasis HLB固相萃取柱对6种硫脲嘧啶类药物进行了净化。提取残留物用2.5mmol/L磷酸溶解，HLB固相萃取柱依次用甲醇、水预淋洗，上样，先用水进行淋洗，再用甲醇洗脱，洗脱液用氮气吹干、复溶后，用LC-MS/MS检测，内标法定量。方法回收率在80%～110%之间，CV小于10%。而GB/T20742-2006也采用Oasis HLB固相萃取柱对硫脲嘧啶类药物的NBD-CI衍生产物进行净化。衍生液用0.2mol/L盐酸调节pH3～4，过Oasis HLB固相萃取柱，用水洗涤，负压下抽干SPE柱10min，再用乙酸乙酯洗脱，氮气吹干，复溶后LC-MS/MS测定。方法回收率在82.8%～92.9%之间，CV在5.23%～9.48%之间。

由于硫脲嘧啶类药物结构中巯基和羟基上活泼氢的存在，也使其可以采用阴离子交换柱净化。Yu等采用阴离子交换树脂AG MP-1净化，分析物替换树脂中的氯离子，被很好地吸附。乙腈提取液用氮气吹至约2mL，加入0.1mol/L NaOH至10mL，过AG MP-1阴离子交换柱，3mL水、3mL甲醇洗涤，抽干15min，加入0.3mL 0.5mol/L碘甲烷乙腈溶液，铝箔避光反应1h后，用1mL乙腈洗脱，GC-MS测定。方法回收率在50%～90%之间，CV小于10%。GB/T20742- 2006用0.5mL三氯甲烷溶解提取残余物，再加入3mL正己烷，涡旋混匀，过Sep-Park Amino Propyl固相萃取柱，待样液全部通过固相萃取柱后用10mL正己烷洗涤，用5mL 3%乙酸甲醇溶液-三氯甲烷(15+85，v/v)洗脱，氮气吹干，再用HLB净化后，LC-MS/MS检测。方法回收率在82.8%～92.9%之间，CV在5.23%～9.48%之间。

同时，由于硫脲嘧啶类药物结构中含有碱性的叔胺基，也可以采用阳离子交换柱净化。Hollosi等建立了鱼肉中甲巯咪唑、甲硫脲、甲脲乙醇酸酐和巯基咪唑的残留分析方法。鱼肉样品用4倍质量的水在4℃匀浆，离心，取1mL上清液，加入10μL 50%磷酸，再过Oasis MCX柱(已依次用甲醇和水平衡)，3mL 90%甲醇溶液(氨水调pH12)洗脱，洗脱液氮气吹干，用水复溶后HPLC检测，方法回收率在85.2%～97.6%之间。

3)基质固相分散萃取(matrix solid phase dispersion， MSPD)

MSPD的原理是将固相萃取材料与样品一起研磨，得到半干状态的混合物并将其作为填料装柱，然后用不同的溶剂淋洗柱子，将各种待测物洗脱下来。其优点是浓缩了传统的样品前处理中的样品匀化、组织细胞裂解、提取、净化等过程，不需要进行组织匀浆、沉淀、离心、pH调节和样品转移等操作步骤，避免了样品的损失，适用于多种药物的残留分析。
Zou等建立了一种基于MSPD的快速分析牛奶与尿液中硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶、丙基硫脲嘧啶、苯基硫脲嘧啶和甲巯咪唑的残留分析方法。样品与硅胶混合均匀，装入SPE柱中，室温干燥40min，用10mL甲醇-氯仿(5+95，v/v)洗涤，6mL甲醇-氯仿(20+80，v/v)洗脱，洗脱液氮气吹干，经衍生化后用GC-MS测定。5种药物的回收率在70%以上，RSD在2.1%～7.9%之间；甲巯咪唑的LOD为0.004μg/g，其他药物为0.0016μg/g。Zhang等也采用类似的硅胶MSPD提取动物组织中的5种硫脲嘧啶类药物，再用硅胶柱净化其PFBBr衍生物，GC-MS测定。硫脲嘧啶、甲基硫脲嘧啶和丙基硫脲嘧啶的LOD为10μg/kg，苯基硫脲嘧啶为20μg/kg，甲巯咪唑为50μg/kg；方法回收率超过70%，RSD在4.5%～8.7%之间。

4)凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography，GPC)

GPC柱中可供分子通行的路径有粒子间的间隙(较大)和粒子内的通孔(较小)。当混合物溶液流经色谱柱时，较大的分子被排除在粒子的小孔之外，只能从粒子间的间隙通过，速率较快；而较小的分子可以进入粒子中的小孔，通过的速率要慢得多。经过一定长度的色谱柱，分子根据相对分子质量被分开，相对分子质量大的在前面(即淋洗时间短)，相对分子质量小的在后面(即淋洗时间长)。以此原理，可以将药物分子与脂肪等生物大分子分离，达到净化目的。

Abuin等建立了甲状腺中6种硫脲嘧啶类药物的UPLC-MS/MS分析方法。样品用乙酸乙酯提取，采用凝胶渗透色谱(GPC)净化，Waters Envirogel GPC柱(19mm×300mm)，乙酸乙酯-环已烷(1+1，v/v)洗脱，流速5mL/min，254nm处观测，收集15～21min的流出液，氮气吹干后用去离子水复溶，UPLC-MSMS测定。该方法LOQ在50～500μg/kg之间，CCa为1～15ug/kg，CCβ为6～25μg/kg，RSD在2%～14%之间。同时，与硅胶SPE净化进行了比较，硅胶SPE柱的回收率在40%～79%之间，GPC的回收率在80%～109%之间。