(4)免疫分析法(immunoanalysis，IA)

免疫学分析方法是基于抗原-抗体特异性反应建立起来的测定方法，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度较高、特异性强等诸多优点，缺点是假阳性率较高。

1)酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

Cooper等首先应用AOZ的衍生物CPAOZ连接HAS制备完全免疫抗原，并成功得到敏感性高、特异性强的多克隆抗体，对除AOZ以外的NFs代谢物和其他化合物几乎不存在交叉反应。IC50值为0.065μg/L，可检测出样品中的AOZ的浓度为0.3μg/kg，为呋喃唑酮代谢物的免疫分析方法奠定了基础。随后，Cooper等又建立了虾组织中AOZ的ELISA分析方法，方法检测限为0.1μg/kg，批内和批间RSD分别为18.8%和38.2%。Cheng等建立了鱼中AOZ的ELISA检测方法。通过得到敏感性和特异性较好的多克隆抗体，对样品中经衍生化反应后的NPAOZ进行检测。兔多抗由免疫抗原(2-NP-HXA-AOZ)免疫产生，AOZ的IC50为0.14μg/kg，检测限为0.025μg/kg，远远低于欧盟所要求的1μg/kg。应用此方法，检测了370份实际鱼肉样品，以AOZ的浓度为0.3μg/kg作为判定界限，此ELISA方法的敏感性为100%，与HPLC相比(0.3μg/kg)特异性为98.5%，并没有出现假阴性结果。Diblikova等应用ELISA方法检测动物组织中AOZ的残留量。对于虾肉、禽肉、牛肉、猪肉的无假阳性检测浓度水平为0.4μg/kg，在虾肉中添加浓度水平为0～32.1μg/kg的范围内，ELISA与LC-MS/MS方法的相关性为0.999，而在禽肉中添加浓度水平为0～10.5μg/kg的范围内，两种方法的相关性也很好。沈美芳等的研究表明，运用ELISA法测定水产品中AOZ残留时，稀释倍数对回收率影响显著，乙酸乙酯提取次数、光照条件和放置时间对测定结果无显著影响。用该方法对鱼、虾、蟹进行加标回收率试验，0.60～6.00μg/kg加标水平的回收率为87%～11.8%，CV为1.76%～12.57%。
蒋宏伟应用ELISA技术，用针对兔IgG的羊抗体包被微量反应板，对蜂蜜、猪肉、牛肉、蛋粉、奶粉、牛尿等动物产品中的AOZ、AMOZ进行了检测。作者认为该ELISA法采用了AOZ或AMOZ特异性抗体，精确度、灵敏度均较高，具有经济、操作简便、检测时间短等优点，适合于大量动物产品样本中呋喃唑酮、呋喃它酮残留量检测的快速筛选。Pimpitak等建立了虾肉中AMOZ的ELISA方法。该方法获得了针对AMOZ的两种高特异性单克隆抗体，其中一种仅仅针对呋喃它酮和AMOZ产生高特异性结合，不与其他化合物发生交叉反应。竞争ELISA方法中其IC50针对AMOZ和呋喃它酮分别为5.33ng/mL、1.33ng/mL，检测限可以达到0.16μg/kg。

王钦晖等采用间接竞争ELISA方法测定了猪肉中呋喃妥因代谢物AHD。在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物AHD经衍生化后和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗呋喃妥因代谢物的衍生物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物AHD代谢物的含量成负相关，与标准曲线比较即得出样本中呋喃妥因代谢物的残留量。

Vass等应用分子模拟研究抗原的合成，获得呋喃西林代谢物SEM的多克隆抗体，并建立直接竞争ELISA方法。得到的SEM多抗IC50为0.06～2.28μg/L，线性范围为0.01～0.2ug/L。在0.5～20ug/kg范围内，方法的回收率在82%～105%之间，CV小于15.5%。在没有假阴性结果的前提下，肌肉中方法的灵敏度可达到0.3μg/kg。Cooper等建立了鸡肉中SEM的ELISA方法，与呋喃西林的交叉反应率为1.7%，在一定范围内与其他呋喃类药物几乎不存在交叉反应。方法CCβ为0.25μg/kg，此方法同时也可用于鸡蛋和鸡肝样品中SEM的检测。

2)胶体金免疫层析法(immune colloidal gold technique，GICT)

潘心红等用小牛血清蛋白(BSA)偶联的AMOZ免疫小鼠，制得杂交瘤细胞，得到纯化好的抗AMOZ单克隆抗体，并制得胶体金试纸条。用胶体金试纸半定量法直接测定鱼肉中呋喃它酮代谢物AMOZ的含量。结果表明，与AOZ、AHD无交叉反应，检测灵敏度可达2.5μg/kg，回收率在80%～91%之间，相关性良好。该方法测定的结果与HPLC法相符，无显著性差异。

3)荧光免疫分析法(fluoroimmunoassay，FIA)

沈玉栋等首次建立了呋喃西林代谢物SEM的荧光偏振免疫分析(FPIA)方法。通过设计合成新的SEM半抗原CEPSEM，偶联载体蛋白后免疫新西兰大白兔，制备亲和力高、特异性好的多克隆抗体。在示踪物浓度为0.5nmol/L，抗体稀释度为1/100的优化条件下，IC50为47.9μg/L，检出限为8.3ug/L，线性范围为15.8～145.7μg/L。该方法特异性强，和其他相关善药交叉反应小于0.1%，稳定性好，批内RSD小于2.5%，批间RSD小于6.3%。

4)免疫传感器(immunosensor)

Yang等在传统的无标记电化学阻抗滴定免疫传感器的基础上，建立了一种快速可靠的电化学方法检测AOZ。AOZ单克隆抗体(AOZ-McAb)通过EDC和NHS所产生的稳定的酰基氨基酯中间体在金电极.上包被，它可冷凝自组装单层(SAM)上的抗体。通过电化学阻抗谱(E1S)测量AOZ和AOZ-McAb免疫反应前后的电荷转移电阻的相对变化而实现对AOZ的检测。在优化条件下，电荷转移电阻的相对变化与AOZ浓度的对数值成比例，在20.0～1.0×104ng/mL(r-0.9987)之间。同时，这个免疫传感器对AOZ具有很高的选择性，对AMOZ、SEM和AHD没有显著反应。在实际样品的AOZ检测中具有良好的效果。

5)生物芯片(biochip)

O'Mahony等将基于化学发光生物芯片阵列感测技术应用到蜂蜜中NFs残留筛查。通过这种复合技术，4种NFs代谢物可以被同时检测。分别针对各代谢物的特异性抗体被点到生物芯片上，竞争性分析通过化学发光反应展开。该方法按照欧盟法规2002/657/EC的规定进行了验证。采用相似的提取方法，即用OasisSPE提取，再用2-NBA衍生化，乙酸乙酯萃取，与UPLC-MS/MS方法进行了比较。该生物芯片阵列感测技术可以检测执行限浓度(1μg/kg)下的4种代谢物，AHD、AOZ和AMOZ的检测能力低于0.5μg/kg，SEM低于0.9μg/kg，IC50从0.14μg/kg(AMOZ)到2.19μg/kg(SEM)。这种生物芯片技术在食品安全研究领域具有很好的应用前景。

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