6.2.3.6 测定

(1) 液相色谱条件

色谱柱：Atlantis C18，3um，150mm×2.1mm(内径)或相当者；流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液，C为甲醇。梯度洗脱条件见表6-15；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL。

(2) 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；电喷雾电压：5500V；雾化气压力：0.24MPa；辅助气流速：0.4L/min；离子源温度：550℃；碰撞室出口电压：2.0V；定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压，见表6-4。

(3)定性测定

被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差±2.5%之内；且样品中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标准工作溶液中被测物的各定性离子相对丰度的比值k，偏差不超过表1-5规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。

(4)定量测定

在仪器最佳工作条件下，以基质标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。用基质标准工作溶液的工作曲线对样品进行定量，应使样品溶液中林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素的响应值在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素的保留时间见表6-4。林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素的标准物质多反应监测(MRM)色谱图见图6-3。

6.2.3.7 分析条件的选择

(1) 提取溶液的选择

对不同pH条件下Tris溶液从蜂王浆中提取大环内酯类药物的效率进行了对比实验，实验结果见表6-24。

表6-24 不同提取溶液的提取效果(峰高，峰面积)

从表6-24中数据可以看出，提取液的pH条件对蜂王浆中提取大环内酯类药物的效率有很大影响。对于峰高：测定林可霉素，合适的pH条件范围是在8.5、9.0、9.5之间；测定红霉素，合适的pH条件范围是在8.0、8.5、9.0、9.5之间，并随着pH的增加而增加；测定替米考星，合适的pH条件范围是在8.0、8.5、9.0、9.5之间；测定泰乐菌素，合适的pH条件范围是在9.0、9.5之间；测定螺旋霉素，合适的pH条件范围是在8.0、8.5、9.0、9.5之间；测定吉他霉素，合适的pH条件范围是在8.5、9.0、9.5之间；测定克林霉素，合适的pH条件范围是在8.0、8.5、9.0、9.5之间；测定交沙霉素，最合适的pH条件范围是在9.0、9.5之间。

对于峰面积：林可霉素在pH条件范围8.5、9.0、9.5之间没有明显变化，在pH条件范围8.0、8.5、9.0、9.5之间没有明显变化，红霉素随着pH的增加而增加；替米考星在pH条件范围8.0、8.5、9.0、9.5之间没有明显变化，测定泰乐菌素在pH条件范围9.0、9.5之间没有明显变化，螺旋霉素在pH为9.0时最高，吉他霉素在pH为9.0时最高，克林霉素在pH条件范围9.0、9.5最大，交沙霉素最合适的pH条件范围是在9.0、9.5之间；所以本方法采用pH为9的Tris溶液作为提取液。

(2) 质谱条件的优化

采用注射泵直接进样方式，以20μL/min的速度将大环内酯类抗生素混合标准溶液注入离子源，用正离子检测方式对8种大环内酯类抗生素进行一-级质谱分析(Q1扫描)，得到质子化分子离子峰分别为407、734、869、916、425、843、772、828，再对质子化分子离子进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子信息。然后对去簇电压(DP)，碰撞气能量(CE)，电喷雾电压、雾化气等进行优化，使分子离子与特征碎片离子对强度达到最佳。然后将质谱仪与液相色谱联机，再对离子源温度，辅助气流速进行优化，使样液中8种抗生素离子化效率达到最佳。

(3) 液相色谱-串联质谱测定质谱条件

用系列基质混合标准工作溶液，分别进样。在仪器最佳工作条件下，以基质混合标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中八种大环内酯类抗生素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。