3)免疫亲和色谱(immunoffinity chromatography，IAC)

IAC的原理是将抗体固定在固相载体材料上，制成免疫亲和吸附剂，将样品溶液通过吸附剂，样品中的目标化合物因与抗体发生免疫亲和作用而被保留在固相吸附剂上。然后用缓冲液或有机溶剂作为洗脱剂，使目标化合物与抗体解离，从而使目标化合物被萃取和纯化。与传统的SPE相比，利用抗原-抗体结合机制进行净化的IAC柱具有更好的选择性，净化效果好，可重复多次使用，但是一般只能用于单组分或特定种类化合物残留的净化。

徐燕等将去氢甲睾酮多克隆抗体同CNBr-Sepharose 4B 进行偶联，制成了对去氢甲睾酮具有特异性免疫性吸附的IAC柱，并优化了制备和使用条件；同时，用间接竞争酶联免疫(ELISA)和HPLC法对该IAC柱的性能进行了评价。CNBr-Sepharose4B偶联抗体的最佳反应时间为2.5h，抗体最佳初始质量浓度为0.5mg/mL，IAC的柱容量约为1700ngDMT/g干胶，最佳洗脱溶液为80%甲醇溶液。该柱平均加标回收率为97.87%，重复使用三次后，回收率仍不低于90%。Gasparini等建立了一种同时检测牛尿中诺龙、群勃龙残留的LC-MS/MS确证分析方法。牛尿用β-葡糖苷酸酶过夜酶解，冷却至室温后，离心收集上清液，过IAC柱净化。IAC柱用淋洗液活化后上样，淋洗液和水淋洗，甲醇-水(70+30，v/v)洗脱，氮气吹干，甲醇-水(50+50，v/v)复溶上样。方法CCa为0.54～0.60μg/L，回收率大于64%，批间RSD为1.6%～5.7%，批内RSD为1.6%～6.0%。

4)凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography，GPC)

GPC是根据分析物的相对分子质量或者体积进行分离，相对分子质量大的先流出，相对分子质量小的后流出，适用于脂肪等大分子物质中小分子药物的净化。Kaklamanos等采用GPC净化了肾脂肪中促孕激素(醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸美仑孕酮)。样品经正已烷稀释后，加入二氯甲烷，再用GPC净化。GPC采用1000mm×25mm内径玻璃色谱柱，填充生物珠(S-X3，200～400目)进行净化，流速为5mL/min，最大耐受压力150psi，紫外检测波长设定为254nm。收集35～44min流出液，40℃水浴旋转蒸干，复溶后，反相LC-MS/MS分析。该方法的CCa为0.20～0.22ng/g，CCβ为0.33～0.38ng/g，回收率为72.0%～89.2%。

5)基质固相分散萃取(matrix solid phase dispersion，MSPD)

MSPD是一-种快速、简单、廉价、高效耐用的样品处理技术，其基本操作是把样品直接与适量的反相键合硅胶-起混合研磨，使样品被均匀分散于固定相颗粒表面制成半固态，装入层析柱中，然后采用类似SPE的操作进行洗涤和洗脱。MSPD避免了样品匀化、转溶、乳化、浓缩造成的待测物损失。MSPD技术使用样品量少，要求检测方法具有较高的灵敏度。Dong等开发了基于MSPD原理的净化技术，净化水产品中的雌激素。采用乙腈提取鱼肉和虾肉中4种雌激素(17β-雌二醇、雌三醇、4-羟雌二醇和2-甲氧基雌二醇)，涡动混匀，再加入硫酸镁和氯化钠，混匀后，冷冻离心。将上清液转移，加入50mg乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和100mg无水硫酸镁，涡动混匀后离心。上清液过膜后，直接采用HPLC-荧光检测器(FLD)分析。4-羟雌二醇平均回收率为60%，其他3种药物平均回收率高于80%，日内RSD小于12%。

6)涡流色谱萃取(turbulent flow chromatography，TFC)

涡流色谱技术是利用大粒径填料使流动相在高流速下产生涡流状态，从而对生物样品进行净化与富集。现已经发展成为一种直接进样、快速净化和分离生物样品的前处理技术。Moeller等开发和验证了一种定量检测马血清中35种ASs的方法，可同步检测血清中的雄激素、雌激素、孕激素及其代谢产物。该方法采用二维液相系统(2D-LC)，在线TFC提取，带有电喷雾离子源(ESI)的LC-MS/MS测定，通过SRM或选择离子监测(SIM)对分析物进行鉴定和定量。2D-LC-TFC-MS/MS具体参数:一维分离时采用Thermo Cyclone P提取柱(50mm×0.5mm，60μm)进行稀释血清样品提取，二维分离采用ACE C18分析柱(100mm×2.1mm，3μm)进行反相梯度洗脱，柱温为30℃；流动相分别为0.2%甲酸溶液、甲醇、乙腈异丙醇-丙酮(60+30+10，v/v)和含0.1%氨水的水-乙腈(98+2，v/v)；四元泵用于在线样品提取，二元泵用于反相梯度分离。进样后，血清中分析物经TFC提取，然后转移至二维色谱分离，采用MS/MS检测。该研究对分析物的回收率及基质效应进行了评价，大多数分析物的日间及日内CV均低于20%，准确度差异在20%以内；其LOD及LOQ分别为0.025～10ng/mL和0.125～25ng/mL。该方法已应用于英国良种马内源性甾醇类物质的监测。

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