6.2.5.7 分析条件的选择

(1) 提取

牛奶和奶粉基质为高蛋白质高脂肪样品，甲醇、乙腈以及复合共沉淀剂都能有效的沉淀蛋白。根据样品特点，参考文献，实验了甲醇-0.3%偏磷酸、甲醇-磷酸盐缓冲液、甲醇+复合沉淀剂[Carrez I(0.36M K4Fe(CN)6·3H2O)和Carrez I(1.04M ZnSO4·7H2O)]、乙腈+乙酸乙酯、乙腈、甲醇等。甲醇、甲醇-0.3%偏磷酸体系和甲醇-磷酸盐缓冲液体系沉淀蛋白不理想，高速离心后溶液仍然混浊。甲醇+复合沉淀剂、乙腈+乙酸乙酯体系能够有效沉淀蛋白，但对大环内酯的回收率均不高。甲醇+复合沉淀剂体系可能是因为和复合沉淀剂形成了共沉淀，不利于提取；乙腈+乙酸乙酯体系乙腈能沉淀蛋白，但乙酸乙酯对牛奶中这六种大环内酯提取效率不高，同时乙酸乙酯提取出大量杂质，干扰组分的测定。用纯乙腈既能有效沉淀蛋白又能保证回收率，故实验选取乙腈作提取剂。

(2)净化

在本方法的实验过程中，先后使用了BUNDELUT C18固相萃取柱(3cm3和6cm3)、OasisHLB固相萃取柱(3cm3和6cm3)。结果发现C18柱两种规格、3cm3 HLB柱回收率较6cm3 HLB柱低，浓缩液过柱比较费时流速不好控制。6cm3 HLB固相萃取柱的净化效果最好，柱体不容易堵塞，回收率稳定，故选择6cm3 HLB固相萃取柱为净化柱。在淋洗液的选择上，考虑到一定量的有机溶剂能够淋洗到部分干扰成分，实验了不同比例甲醇-水做淋洗液，甲醇的比例由小到大，2mL淋洗并吹干。结果表明，当甲醇的比例增大到40%，吡利霉素、螺旋霉素开始淋洗出柱体。所以实验选取2mL甲醇-水(3+7)做淋洗液。
在洗脱体积的选择上，通过图6-6累积洗脱曲线上可以看出5mL的甲醇才能够将这六种大环内酯完全洗脱下来。

图6-6 累积洗脱曲线

(3) 监测离子的确定

用蠕动泵以10uL/min注入1μg/mL的混合标准溶液来建立确定各化合物的最佳质谱条件，包括选择特征离子对，优化电喷雾电压、鞘气、辅助气、碰撞能量等质谱分析条件。分析物的混标液进入ESI电离源，在正、负离子扫描方式下分别对分析物进行一-级全扫描质谱分析，得到分子离子峰。5种分析物均在正模式下有较高的响应，负模式下信号值很低。然后对各分子离子峰进行二级质谱分析(多反应监测MRM扫描)，得到碎片离子信息。其具体的质谱条件为：鞘气压力，30unit；辅助气压力，5unit；正离子扫描模式；电喷雾电压，4000V；毛细管温度，320℃；源内诱导解离电压，10V；Q1和Q3狭缝宽度为0.7；碰撞气为高纯氩气，碰撞气压力为1.5mTorr

6.2.5.8 线性范围和测定低限

用定溶液配成0～100ng/mL(相当于牛奶样品0～200μg/kg)一系列标准工作溶液，用牛奶、奶粉样品空白溶液配成一系列基质标准工作溶液，在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定，进样量15uL，用分析物峰面积对基质标准工作溶液中被测组分的浓度作图，其线性范围、线性方程和线性相关系数见表6-40。由不同基质的线性方程可知基质对分析物的测定有一定的影响，所以方法采用基质添加标准来校对样品的含量以消除基质的干扰。

表6-40 线性方程和范围、相关系数

根据最终样液所代表的试样量，定容体积，进样量和进行测定时所受的干扰情况，牛奶中竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吡利霉素为1μg/kg，奶粉中竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吡利霉素为8μg/kg。

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