7.1.3 最大允许残留限量

研究表明NFs能够诱导突变并具有致癌性和慢性毒性，为了保障消费者的健康安全，目前，绝大多数国家已经明令禁止该类药物用于食品动物的生产饲养。澳大利亚于1992年撤销了NFs的最高残留限量，禁止其使用；欧盟于1993年在2377/90/EEC的附录IV中规定禁止将呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮用于食品动物，1995年又将呋喃唑酮列入，并规定检测动物源产品中NFs的方法灵敏度的最低要求为1.0μg/kg)；加拿大于1997年将NFs列为禁用药物；2002年，美国FDA公布了禁止在食品动物中使用的药物名单，其中包括呋喃西林、呋喃唑酮等NFs；2006年，日本实施的“肯定列表制度”也将NFs列入禁用物质清单。我国农业部于2002年颁布了193号公告，将NFs列入《食品动物禁用兽药及其他化合物清单》，在动物性食品中不得检出。

7.1.4残留分析技术

NFs在动物体内代谢快，半衰期短，检测原药不足以反映真实的残留水平和用药情况。在NFs的检测方法研究中,历经了从检测原型药物到检测代谢物的发展历程,而对NFs代谢物残留量的分析，已成为当前研判NFs滥用与否的重要技术手段。同时，由于组织中结合残留物的浓度可能非常低，需要采用高灵敏度的检测技术，液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS)和免疫学方法如酶联免疫吸附法(ELISA)，已成为国际上最常用的硝基呋喃代谢物残留检测方法。

7.1.4.1前处理方法

NFs属于光敏物质，对太阳光特别敏感，因此样品前处理的操作必须避免在强烈光照下进行。

(1)样品洗涤

近年来研究发现，NFs代谢物特别是氨基脲(SEM)产生机理复杂、来源多样，滥用呋喃西林并，不是导致检出SEM的唯一原因。为了准确反映NFs的真实使用情况，降低外源性物质对检测结果的干扰，在部分动物源食品中只测定结合态代谢物，洗去游离态代谢物，可以降低误判的风险。郭德华等依次用甲醇、乙醇和乙醚溶剂提取，使动物源性样品中呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因等4种NFs游离态代谢物进入提取液，而结合态代谢物保留在残渣中。在酸性条件下用2-硝基苯甲醛分别衍生游离态和结合态代谢物，经乙酸乙酯提取浓缩后，用LC-MS/MS检测，同位素内标法定量，将两者测定结果相加即得到样品中NFs代谢物的残留总量。我国国家标准《GB/T21311-2007动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法》对于肌肉、内脏、鱼、虾和肠衣等组织样品，采用甲醇-水(1+1,v/v)充分洗涤后，弃去溶液，只分析结合态的NFs代谢物，避免外源性污染干扰。

(2)水解和衍生化

NFs代谢物主要以蛋白结合物形态存在于有机体组织中，只有在适当的酸性条件下，才能释放出来，通常采用稀盐酸水解组织中的蛋白结合态代谢物。同时，NFs代谢物均为小分子化合物，SEM、AOZ、AHD、AMOZ和DNSAH的相对分子质量分别为75.1、102.1、115.1、201.2和242.1，质谱检测时特征离子少，背景干扰大，检测灵敏度很低，给定性和定量分析带来困难。衍生化则可以增加分子质量，增强化合物的色谱保留，使化合物远离质谱的高噪音质量区，增加特征碎片离子的选择性，提高质谱响应。因此，研究者通过对代谢物的自由氨基进行衍生化，增大化合物的分子量，形成一个具有较好质谱特性的化合物，再进行分析。

通常采用邻硝基苯甲醛(2-NBA)作为衍生化试剂，但需要较长的反应时间，一般要求在37℃下衍生16h。为了缩短衍生化的时间，Alexander等希望用其他芳香族醛(如吡啶-3-羧基甲醛、2,2-二硝基苯甲醛、2-羟基-5-硝基苯甲醛)来提高检测灵敏度或缩短反应时间。然而，并没有明显的改善。实验发现，衍生化反应率大约为70%，且在不同浓度水平下未观察到显著变化。丁磊等比较了40℃恒温振荡16h、水浴超声1h、恒温静置16h等3种条件下2-NBA的衍生效率。研究发现，除AOZ外，其他3种呋喃代谢物衍生效率在40℃水浴超声1h条件下的产率最高。庞国芳等18对比了2-NBA和对硝基苯甲醛(4-NBA)的衍生化效果。结果发现，用4-NBA做衍生化试剂，衍生产物灵敏度较低，衍生时间的延长对质谱信号没有提高，而背景噪音的干扰增加较大。

目前，2-NBA是常用的衍生化试剂。衍生化反应机理可归纳为：在酸性条件下，衍生剂的酮醛基团(-CHO)与不同代谢物的含氮亲核基团氨基(-NH2)发生醛胺亲核加成反应。通过衍生化，NFs代谢物衍生产物的相对分子质量分别达到了208.2、248.2、235.2、334.3和375.3，增大分子质量的同时提高了离子化效率和质谱检测灵敏度。蛋白结合态NFs代谢物在酸性条件下，同步水解和衍生化反应过程见图7-2。

图7-2 蛋白结合态NFs代谢物的同步水解和衍生化过程

也有研究者采用邻氯苯甲醛(2-CBA)或2-萘醛(NTA)作为衍生化试剂。朱坚建立了用LC-MS法测定鸡肉和水产品虾中NFs代谢物AOZ和AMOZ残留量的方法。样品经酸水解，用邻氯苯甲醛衍生化，再经SPE柱净化后，用LC-MS检测，检测低限为0.3×10-9数量级。林黎明等分别以邻氯苯甲醛和邻硝基苯甲醛作为衍生化试剂，用ENSPE柱净化，以AMOZ-d5、AOZ-d4作内标，采用LC-MS分析鸡组织及蛋中4种硝基呋喃类代谢产物。方法回收率为85%～90%，检出限可达0.5μg/kg。Chumanee等叫在测定虾肉中4种NFs代谢物中，引入了一种新的衍生化试剂——2-萘醛(NTA)。20g虾肉样品在0.2mol/LHCI的酸性条件下，加入20mmol/L的NTA、0.12g NaOAc、1gKCl，37℃避光过夜反应。衍生化之后用乙酸乙酯提取，最后用正已烷液液萃取除脂。衍生化的NFs代谢物在ChromSpher 5 C18柱(250mm×4.6mm，5μm)上进行分离，洗脱顺序为NTAHD<NTSEM<NTAOZ<NTAMOZ，二极管阵列检测器(DAD)进行测定，NTAHD的检测波长为310nm，其余为308nm。在1μg/kg、1.5μg/kg、2μg/kg三个浓度水平水平进行添加回收实验，回收率高于86%，变异系数(CV)小于14%。AHD、AOZ、SEM、AMOZ的定量限(LOQ)分别为0.7803μg/kg、0.7973μg/kg、0.6973μg/kg和0.9118μg/kg，检出限(LOD)均在0.2μg/kg左右。该方法为NFs代谢物的检测提供了更多的选择。

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