(2)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)

在HPLC检测中，反相C18色谱柱是目前GCs分离最常用的液相色谱柱，而酸性流动相有助于改善峰形，通常采用甲醇或乙腈-甲酸溶液，甲酸的浓度通常采用0.1%～0.5%，也有采用乙酸铵溶液和三氟乙酸溶液的报道。GCs常用的检测器主要有紫外检测器(ultraviolet detector，UVD)、荧光检测器(fluorescencedetector，FLD)和化学发光检测器(electrochemical detector，CLD)等。

1)紫外检测器(UVD)和二极管阵列检测器(DAD/PDA)

UVD是HPLC方法中常用的检测器。GCs在紫外(200～400nm)有强吸收，但在200nm处基质干扰严重；多数GCs有共轭双键，在240nm有强吸收，基质干扰减少，采用最多。

Shearan等建立了牛组织中地塞米松的反相HPLC-UVD检测方法。肌肉、肾脏和肝脏用乙酸乙酯提取，脂肪用乙醚提取，甲泼尼龙作为内标，C18固相萃取柱净化后，用C18柱(250mm×4.6mm，5μm)分离，甲醇-水(70+30，v/v)为流动相，在254nm处检测。地塞米松的LOD为0.01mg/kg。

Desi等建立了牛奶中地塞米松和泼尼松龙残留检测方法。采用MSPD提取和净化，C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)分离，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为1mL/min，柱温为40℃，进样量为100uL，DAD在240nm检测。地塞米松和泼尼松龙的LOD分别为0.075μg/kg和0.50μg/kg，回收率分别为52.9%～64.7%和59.0%～64.1%，RSD分别为3.0%～4.1%和2.9%～5.1%。

Grippa等建立了HPLC方法测定马血清中的氢化可的松、地塞米松等药物。用乙酸乙酯提取，氮气吹干后，甲醇复溶，进HPLC分析。C18柱分离，流动相为乙腈-水(51+49，v/v，含0.1%三氟乙酸)，流速1mL/min，254nm处检测，以丙磺舒为内标定量。方法LOQ为0.25μg/mL，批内和批间CV分别为3%～6%和9%～15%。Zhang等120)建立了检测血浆和尿液中氢化可的松和泼尼松龙的HPLC-DAD方法。使用乙酸乙酯提取，Hypersil-ODS色谱柱(125mm×4.0mm，5.0μm)分离，流动相采用甲醇-水(60+40，v/v)，流速1mL/min，进样量20μL，柱温25℃，DAD在200～380nm检测。方法的回收率为88.4%～104.4%；尿液中泼尼松龙的LOD和LOQ分别为1.7ng/mL和5.2ng/mL，氢化可的松的LOD和LOQ为0.8ng/mL和2.5ng/mL；血浆中泼尼松龙的LOD和LOQ分别为1.0ng/mL和3.0ng/mL。盛欣等建立了测定血液和尿液中倍他米松的HPLC-UVD法。以乙酸乙酯为萃取剂、泼尼松为内标。用C18柱(250mm×4.6mm，5μm)分离，甲醇-水(60+40，v/v)为流动相，检测波长240nm测定。倍他米松在血液和尿液中的线性范围为0.1～20μg/mL，r2大于0.999；LOD均为0.02μg/mL；平均回收率为91%～104%，日内、日间RSD小于4.6%。

2) 荧光检测器(FLD)

FLD也是HPLC常用的一种检测器。用紫外线照射色谱馏分，当试样组分具有荧光性能时，即可检出。FLD选择性高，只对荧光物质有响应；灵敏度也高，最低检出限可达10～12ug/mL，适合于各种荧光物质的痕量分析，也可用于检测不发荧光但经化学反应后可发荧光的物质。Wu等建立了血浆中倍他米松和地塞米松的HPLC-FLD检测方法。血浆经C18固相萃取柱净化，洗脱液用离心蒸发器60℃蒸干，加入100μL 1-乙氧基-4-(二氯-S-三嗪基)萘(1.0mmol/L)溶解，再加入约50mg碳酸钾，40℃水浴振荡反应1h后，用C18色谱柱分离，乙腈-水(60+40，v/v)作为流动相，FLD检测(激发波长360nm，发射波长410nm)。方法线性范围在2.5～50.0pmol之间，LOQ为80.0fmol/20uL，回收率均优于90%。

3) 化学发光检测器(CLD)

CLD的原理是某些物质在常温下进行化学反应，生成处于激发态势反应中间体或反应产物，当它们从激发态返回基态时，就发射出光子。由于物质激发态的能量是来自化学反应，故叫作化学发光，其光强度与该物质的浓度成正比。这种检测器不需要光源，也不需要复杂的光学系统，只要有恒流泵，将化学发光试剂以一定的流速泵入混合器中，使之与柱流出物迅速而又均匀地混合，产生化学发光，通过光电倍增管将光信号变成电信号，就可进行检测。CLD有设备简单、价廉、线性范围宽、快速、灵敏等优点。

Iglesias等建立了牛肝脏中地塞米松的HPLC-CLD检测方法。采用氢氧化钠溶液和乙酸乙酯提取组织样品，离心后蒸干，乙腈复溶，正己烷脱脂，以乙腈-0.5mmol/L乙酸铵溶液(pH6.0，40+70，v/v)为流动相，C18色谱柱分离，发光氨作为化学发光试剂，CLD检测。方法回收率高于80%，LOD达到0.2ppb。Zhang等建立了在线电解生成[Cu(HIO6)2]5-发光氨化学发光-HPLC法检测猪肝脏中的7种GCs。基于GCs对[Cu(HIO6)2]5-发光氨的化学发光信号的增敏作用，流动注射在线电解生成[Cu(HIO6)2]5-发光氨，化学发光检测GCs。采用Nucleosil RP-C18色谱柱(250mm×4.6mmi.d，5μm)分离，乙腈-1.0mmol/L乙酸铵溶液(pH6.8，40+60，v/v)为流动相，流速为8mL/min。在添加浓度5～50ng/g范围，方法回收率在88%～106%之间，RSD为2.0%～6.9%。