10.1.4.2 测定方法

GCs的测定方法主要有毛细管电泳法(CE)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、气相色谱质谱法(GC-MS)和免疫学方法(IA)等。

(1)毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)

1)毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis，CZE)

CZE是CE中最常见的分离模式，是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为。上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。CZE用以分析带电溶质，样品中各个组分因为迁移率不同而分成不同的区带。Baeyens等建立了检测泪液中地塞米松磷酸钠及其代谢物地塞米松的CZE方法。电泳缓冲液为100mmol/L四硼酸钠缓冲液，电压为25kV，5kPa压力进样，时间20s，毛细管柱的总长度为64.5cm、有效长度为56.0cm、内径为50um、外径为375um，柱温为25℃，二极管阵列(DAD)检测器在190～600nm全波长扫描。该方法的LOD和LOQ分别为0.5μg/mL和2.0μg/mL，线性范围为2～100ug/mL。

2)毛细管胶束电动力学色谱(micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC)

MECC为一种基于胶束增溶和电动迁移的新型液体色谱，在缓冲液中加入离子型表面活性剂作为胶束剂，利用溶质分子在水相和胶束相分配的差异进行分离。MECC柱效高，流行平面没有谱带扩展，散热好，胶束本身处于动态，和离子接触多，分离效率高。由于应用的表面活性剂的种类不同，明显改变分离效果，加有机感性剂，可改变MECC选择性，从而大大提高分离效能。适合于中性物质的分离，还可以分析离子，亦可区别手性化合物，而且，成本低，操作简单。Noe等建立了检测血清中泼尼松龙的MECC方法。血清样品经C18固相萃取柱净化，在一-定的压力(20mbar，0.06min)下注入熔融石英毛细管(id.50mm，总长度66cm，有效长度49.5cm)，自动进样器的温度为20℃±0.1℃，毛细管炉的温度为25℃±0.1℃，采用30kV恒压(电流为65mA)在10min内分离，磷酸盐-四硼酸盐缓冲液(pH8.0，20mmol/L)用于定量测定泼尼松龙，紫外检测器(UVD)在254nm检测。该方法的线性范围为0.5～4μg/mL，相关系数为0.990，LOD为250ng/mL，LOQ为500ng/mL。

3)加压毛细管电色谱(pressurized capillary electrochromatography，pCEC)

pCEC是近年发展起来的一种新型微分离分析技术，它整合了CE与HPLC的优点，通过在填充有HPLC填料的毛细管电色谱柱两端施加高压直流电场，样品在CE柱中的保留行为同时受到电渗流及其在流动相与固定相之间分配系数的影响，双重分离机制大大提高了样品分离能力，适用于复杂生物样品中待测物的分离。结合毛细管柱上检测技术，pCEC可与UVD、荧光检测器(FLD)、激光诱导荧光检测器(LIF)、电化学检测器(ECD)及质谱(MS)等多种检测手段联用。李博祥等采用反相pCEC-UVD技术，建立了一种高效、简便的GCs分析方法，适用于毛发中GCs的检测。使用C18反相毛细管填充柱(内径100um，毛细管全长45cm，有效长度20cm，ODS填料粒径3um)，流动相为1.5mmol/L的Tris-乙腈溶液(pH8.0，65+35，v/v)，检测波长为245nm、分离电压为-10kV、反压阀压力为10.5MPa、泵流速为0.05mL/min，进行等度洗脱，倍他米松、地塞米松、泼尼松、泼尼松龙、醋酸泼尼松龙、醋酸氢化可的松、醋酸可的松、皮质脂酮等8种GCs在20min内实现快速分离。各组分的质量浓度线性范围达到3个数量级，迁移时间和峰面积的RSD分别小于4.8%和7.4%；不同浓度GCs的回收率为71%～85%；方法LOQ分别为:泼尼松龙0.72ug/g、泼尼松0.72ug/g、倍他米松0.59μg/g、地塞米松1.37ug/g、醋酸可的松1.41μg/g、醋酸泼尼松龙1.07ug/g、醋酸氢化可的松1.03ug/g、皮质脂酮1.36μg/g。

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