14.1.4.2测定方法

动物源样品中吡唑酮类药物的测定方法主要有流动注射化学发光检测法、超临界流体色谱法(SFC)、毛细管电泳法(CE)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)和免疫分析法等。色谱法(包括色质联用法)具有更好的分辨率、灵敏度和重复性，是目前残留分析中采用最多的技术;而免疫分析方法具有简便、快速、灵敏度高等优点，应用于残留分析越来越受到重视。

(1)流动注射-化学发光法(flow injection-chemiluminescence detection，FI-CL)

流动注射-化学发光分析法是将流动注射与化学发光相结合的-种分析方法。流动注射是指在非热力学平衡条件下，在液流中重现处理试样或试剂区带的定量流动分析技术，它具有高精度、高效率、快速的特点。化学发光是基于反应体系中某种物质(反应物、产物、中间体)的分子吸收了反应所释放的能量而由基态跃迁至激发态，然后再从激发态返回基态，同时将能量以光辐射的形式释放出来产生化学发光。基于分子发光强度和被测物含量之间的关系建立的分析方法称为化学发光分析法，具有灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单等优点。将二者结合而产生的流动注射化学发光分析法具有分析速度快、精度高、易实现自动化等特点。何云华等将流动注射，分子印迹技术与化学发光检测方法相结合，分析尿液中的安乃近。利用MIP对目标分子的识别和捕获能力，使目标分子吸附在MIP上，从而与样品中的共存物质分离，然后进行化学发光检测，消除共存物质的干扰，提高化学发光分析的选择性。向一根4mm×15mm的玻璃管内填充10.0mg分子印记材料，两端塞少许玻璃棉，使用前，使锰(IV)溶液和甲醛溶液的合并流通过MIP柱，除去MIP上的模板分子安乃近。当试剂合并流通过MIP柱时，与柱上吸附的安乃近发生化学发光反应，产生发光信号，随着MIP中安乃近的不断消耗，发光信号逐渐降低，当其与背景信号相同时，即可认为MIP柱中安乃近已经除尽。该方法线性范围为1.0×10-7～1.0×10-5mol/L，LOD为4×10-8 mol/L，对1.0×10-6 mol/L安乃近溶液平行测定7次，RSD为2.4%，可用于尿液中安乃近的直接测定。

(2)超临界流体色谱法(supercritical fluid chromatography，SFC)

SFC是以超临界流体做流动相，依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析的色谱过程，是20世纪80年代发展和完善起来的一种新技术。Simmons等利用SFC测定血清中保泰松和羟布宗。色谱柱为Deltabond ODS (250 mm×1mm)，流动相为二氧化碳-甲醇(95+5，v/v)，泵压为170大气压，炉温85～90℃，紫外检测波长为240nm，测定时间为10～12min。该方法LOD为0.1μg/mL(保泰松)和1.0μg/mL(羟布宗)，CV为0.24%～4.94%，回收率在82%～83%之间。

(3)毛细管电泳法(capillary electrophoresis， CE)

CE是在电场作用下，利用毛细管中被分析的带电分子因移动速率的不同而达到分离的目的，是以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。分析时，将毛细管内充满电解液，毛细管两端通高压电，使电解液内带电分子移动到毛细管相反电荷的一端。分子大小不同，电荷比不同，在管中移动的速率也不同，从而到达毛细管终点有快有慢，依此分离不同分子。Perrett等采用CE测定唾液中的安替比林。唾液样品离心后直接进CE测定。缓冲液为25mmol/L四硼酸钠和50 mmol/L SDS (pH 9.6)，水动力(hydrodynamic)上样，上样时间10s，运行电压25kV，温度25℃，进样量50uL，检测波长为260nm。该方法回收率为99.6%±4.8%，LOD为10 umol/L。

(4)气相色谱法(gas chromatography， GC)

GC具有高效的分离能力和较高的灵敏度，能对样品进行有效分离。同时，满足检测器对待测物单一性的要求，极大地提高了对混合物的分离、定性和定量分析效率。GC分析安替比林及其代谢物可选用氮磷检测器(nitrogen-phosphorus detector，NPD)和火焰离子化检测器(flame ionization detector，FID)。氨基比林、安替比林及其代谢物可以不衍生直接测定”。

1)NPD检测

Abernethy等检测血浆中安替比林和氨基比林残留，用GC-NPD测定。色谱柱为填充3% SP-2250的玻璃柱(1.83m×2mm)，载气为氦气，流速为30mL/min，检测器清洗气为氢气和干燥空气，流速分别为3mL/min、50mL/min，进样口温度310℃，柱温230℃，检测器温度275℃。该方法LOD为1μg/mL，回收率大于95%，CV小于6.6%。Shively等测定唾液中的安替比林和氨基比林，氯仿提取液转换溶剂后，不衍生直接进GC-NPD测定。色谱柱为装填3% SP-2250 DB的玻璃柱，不分流进样，进样体积1μL，柱温、进样口温度和检测器温度分别为230℃、250℃和275℃，载气为氦气，流速4mL/min。安替比林和氨基比林的线性范围均为0～10μg/mL，CV为1.7%和2.4%，平均回收率为87%和95%。

2)FID检测

Inaba等采用GC测定了尿液中安替比林代谢物。经酶解的尿液样品用乙酸乙酯提取后，不衍生直接进GC-FID测定。色谱柱为装填3% OV-17的玻璃柱(2mm×120cm)，柱温为195℃，载气为氮气，流速30mL/min尿液中NORA的LOD为1pg/mL，OHA为10pg/mL；NORA的CV小于3.1%，OHA为8.9%。

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