15.2.2.1 适用范围

适用于牛奶和奶粉中卡巴氧代谢物喹噁啉-2-羧酸和喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留量的液相色谱-串联质谱测定。方法检出限：喹噁啉-2-羧酸和3-甲基喹噁啉-2羧酸的方法检出限牛奶为0.5μg/kg，奶粉为4.0ug/kg。

15.2.2.2 方法原理

用甲酸溶液消化试样，使牛奶和奶粉中天然存在的酶失活，然后加入蛋白酶水解，盐酸酸化，离心过滤后，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定卡巴氧代谢物喹噁啉-2-羧酸和喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留，内标法定量。

15.2.2.3试剂和材料

甲醇、甲酸：色谱纯；乙酸钠、乙酸乙酯：分析纯。

2%甲酸-乙酸乙酯溶液：向400mL乙酸乙酯中加入10mL甲酸，用乙酸乙酯定容至500mL；0.6%甲酸溶液：量取6.0mL甲酸，用水溶解、定容至1L；0.1%甲酸溶液。量取1.0mL甲酸，用水溶解、定容至1L；甲酸-甲醇溶液(19+1，v/v)：用190mL甲酸溶液与10mL甲醇混合；0.1mol/L盐酸溶液：量取8.3mL浓盐酸，用水溶解、定容至1L；0.3mol/L盐酸溶液：量取25mL浓盐酸，用水溶解、定容至1L；Protease 蛋白酶：SigmaP5147 或相当者，-18℃以下保存：0.01g/mL蛋白酶水溶液：称取1.00g Protease蛋白酶，用水溶解、定容至100mL，4℃保存；10%乙酸溶液：量取100mL乙酸，用水溶解、定容至1L；0.05mol/L乙酸钠溶液：称取6.8g乙酸钠用800mL水溶解，再滴加10%乙酸溶液以调节溶液pH=7，用水定容至1L；乙酸钠-甲醇溶液(19+1，v/v)：用190mL乙酸钠溶液与10mL甲醇混合；甲醇-水溶液(1+4，v/v)；Tris碱：SigmaT1503或相当者：1.0mol/L Tris溶液：称取121g Tris碱，用水溶解、定容至1L，4℃保存。

喹噁啉-2-羧酸、3-甲基喹噁啉-2-羧酸、喹噁啉-2-羧酸-d4标准物质：纯度≥99%。

标准储备液：100mg/L。准确称取适量标准物质，分别用甲醇溶解定容，配成100 mg/L的标准储备液，在-18℃以下保存。

基质混合标准工作溶液：根据灵敏度和使用需要，用空白样品提取液配成不同浓度(μg/L)的混合标准工作溶液，在4℃保存。

内标工作溶液：准确称取适量喹噁啉-2-羧酸-d4标准物质，用甲醇溶解定容，配成100μg/L的标准工作溶液，在4℃保存。

Oasis MAX固相萃取柱或相当者：60mg，3mL。用前分别用3mL甲醇和3mL水活化，保持柱体湿润。

15.2.2.4 仪器和设备

液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源：固相萃取真空装置：吹氮浓缩仪：旋涡振荡器：分析天平：感量0.1mg和0.01g；真空泵；低温离心机：可制冷到4℃，转速大于5000r/min；移液器量程：10～100μL和100～1000uL；聚丙烯离心管：15mL和50mL，具塞；pH计：精度±0.02pH单位。

15.2.2.5样品前处理

(1)试样制备

取不少于500g有代表性的牛奶或奶粉，充分混匀，分为两份，置于样品瓶中，密封，并作上标记。牛奶置于4℃冰柜中避光保存，奶粉则于室温下置于干燥器保存。

(2)提取

a.牛奶样品：准确称取5g牛奶样品(精确到0.01g)，置于50mL聚丙烯离心管中，加入一定量的内标溶液，使其浓度为2.0ng/g，再加入10mL 0.6%甲酸溶液，混匀后，置于(47±3)℃振荡水浴中振摇1h；然后先加入3mL 1.0mol/L Tris溶液，再加入0.3mL蛋白酶水溶液，充分混匀后，置于(47±3)℃振荡水浴中酶解16～18h。加入20mL 0.3mol/L盐酸，振荡5min，在10℃以5000r/min离心15min，上清液过滤。

b.奶粉样品：取12.5g奶粉于烧杯中，加适量35～50℃水将其溶解，待冷却至室温后，加水至总重量为100g，充分混匀后准确称取5g样品(精确到0.01g)，置于50mL聚丙烯离心管中，按牛奶样品提取步骤进行处理。

(3)净化

将提取步骤所得溶液以约1mL/min的流速全部通过Oasis MAX固相萃取柱，分别用15mL乙酸钠-甲醇溶液淋洗固相萃取柱，真空抽干15min。再用5mL甲醇、3mL水、5mL 0.1mol/L盐酸和3mL甲醇-水溶液分别淋洗，真空抽干15min，然后用2mL乙酸乙酯淋洗固相萃取柱，弃去全部淋出液，最后用3mL甲酸乙酸乙酯溶液洗脱喹噁啉-2-羧酸和3-甲基喹噁啉-2-羧酸，置于15mL聚丙烯离心管中，在45℃用氮气浓缩仪吹干。准确加入1.0mL甲酸-甲醇溶液溶解残渣，过0.2um滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

(4)空白基质溶液的制备

称取阴性样品5g(精确到0.01g)，按上述提取净化步骤操作。

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