(3)高效液相鱼谱法( high performance liquid chromatography， HPLC)

喹噁啉类药物及其代谢物多属中等极性，大多选用反相HPLC分离，流动相主要选用甲醇、乙腈和水，通过调节三者比例和梯度条件，各药物可得到较好的分离；同时，流动相的pH影响待测物的存在形态，需要注意选择合适的pH范围。本类药物及其代谢物的共平面共轭结构，具有紫外吸收特性。QCA和MQCA都有三个较强的吸收峰，吸收波长分别为204nm、 245nm和320nm；其他几种药物的UV-Vis吸收图见图15-3。因而，本类药物HPLC检测最常用的检测器为紫外检测器(ultraviolet detector，UVD)和二极管阵列检测器(diode-array detector，DAD；photo-diode array detector，PDA)。

图15-3几种喹噁啉类药物的UV-Vis光谱图
(a)CYX；(b)BDCYX

1)直接测定

Nasr等优化和验证了一个测定鸡肉、鸡肝、牛肉、牛肝和牛奶中CBX和OLQ残留量的HPLC方法。采用C18柱分离，以10%乙腈和含0.3%三乙胺的0.02mol/L磷酸缓冲液(pH4)作为流动相，梯度洗脱，在373nm波长检测。该方法能够在四分钟能完成分析测定，CBX和OLQ的回收率分别在89.2%～93.6%和93.0%～107.2%范围内。张小军等用HPLC测定动物组织中OLQ残留标示物MQCA。色谱柱为Sunfire C18柱(250 mm×4.6mm，5um)，流动相为甲醇-1.0%甲酸(40+60，v/v)，流速1.0mL/min，柱温30℃，进样量50μL，检测波长320nm。猪肉、牛肉、对虾和草鱼的回收率为82.1%～90.3%，LOQ为4.0μg/kg。 实验对同规格的ZORBAX SB-C18、Sunfire C18和X-Bridge C18三种色谱柱进行了比较，ZORBAX SB-C18和X-Bridge C18出峰较早，但有杂峰干扰，Sunfire C18出峰相对较晚，且分离效果好。实验还比较了甲醇-1%甲酸(40+60，v/v)、甲醇-0.5%甲酸(30+70，v/v)两组等度洗脱，以及甲醇、水和乙酸-乙酸钠缓冲液梯度洗脱，发现以甲醇-1.0%甲酸(40+60，v/v)作为流动相时，色谱峰形和灵敏度最好。
QCA和MQCA等代谢物与喹恶啉类药物原形极性差异较大，同一色谱条件不易操作，可以分别进样测定。Huang等测定鸡血液、肌肉、肝脏、肾脏和脂肪中CYX及其代谢物，HPLC色谱柱为ODS2(5um，250mm×4.6mm)，流速1mL/min，色谱柱温度30℃。CYX和BDCYX的色谱检测条件为：0～8min，乙腈-水(15+85，v/v)，紫外检测波长305nm；8～15min，流动相线性转化为乙腈-水(25+75，v/v)，检测波长为280nm；而QCA的流动相为甲醇-水-甲酸(40+60+10，v/v)，检测波长320nm。CYX和BDCYX的LOQ为0.025mg/kg(血和组织)，回收率在73%～87%之间，日间RSD小于9.86%；QCA的LOQ为0.025mg/kg(血和内脏组织)和0.02mg/kg(肌肉)；回收率为70%～87%，日间RSD为7.69%～11.43%。Zhang等用HPLC测定羊组织中的CYX、BDCYX和QCA。色谱柱为RP18(5um，4.6mm×250mm)，流速1mL/min。CYX和BDCYX的流动相为乙腈-水，梯度洗脱，紫外检测波长分别为305nm和280nm；QCA的流动相为1%甲酸水-甲醇(6+4，v/v)，检测波长为320nm。CYX的回收率为65%～79%，日间CV为6.7%～11.1%；BDCYX的回收率为70%～92%，日间CV为4.7%～15.9%；QCA回收率为70%～82%，日间CV为6.7%～11.1%；三种药物的LOD均为15 μg/kg， LOQ为25 μg/kg。Huang等用HPLC测定猪、鸡肉中QCT及其代谢物。色谱柱为Hyper sil ODS2(250mm×4.6mm)，流速1mL/min，QCT流动相：甲醇-水(55+45，v/v)，BDQCT 流动相：甲醇-水(7+3，v/v)，MQCA流动相：1%甲酸水-甲醇(6+4，v/v)，检测波长为：312nm(QCT)、320nm(BDQCT和MQCA)。该方法回收率为71%～86%，CV为4%～12%；LOQ为0.05mg/kg，LOD为0.025mg/kg。

当代谢物与药物原形同时进样测定时，可以采用梯度洗脱，或者在流动相中添加酸，以降低pH，并增加在反相色谱上的保留性能。梅景良等建立了鱼、虾中OLQ和MQCA的HPLC检测方法。色谱柱为Inertsil ODS-3 C18柱(250mm×4.6mm，5um)，流动相由纯水、乙腈、甲醇和0.5%甲酸水组成，梯度洗脱，柱温30℃，进样量100μL，样品运行时间为20min，双波长检测(OLQ为372nm，MQCA为320nm)。鱼组织中OLQ和MQCA的LOD分别为6ugkg和10ug/kg，LOQ分别为20ug/kg和35μg/kg；虾中的LOD分别为4.5μg/kg和8μg/kg，LOQ分别为15ug/kg和30μg/kg。Zhang等测定猪尿中MQX及其4种代谢物：1-脱氧乙酰甲喹、4-脱氧乙酰甲喹、BDMQX和MQCA。5mL样品中加200μL甲醇和60μL四氯乙烷，超声波萃取4min，离心后HPLC测定。C18色谱柱(5um，4.6mm×250mm)分离，流动相为甲醇-乙腈-水(26+26+48，v/v，含0.1%三氟乙酸)，流速1mL/min，进样量10μL，检测波长320nm。方法LOD为0.16～0.28μg/L，回收率为72.0%～91.3%，CV小于5.2%。Wu等检测动物肌肉、肝脏和鱼肉中MQCA和QCA，用Eclipse XDB C18色谱柱(250mm×4.6mmid.)分离，柱温30℃，流动相为甲醇-1%甲酸(35+65，v/v，pH2.7～3.1)，流速1.0mL/min，检测波长为320nm。QCA和MQCA的CCa为0.7～2.6μg/kg，CCβ为1.3～5.6μg/kg，回收率为70%～110%，CV小于20%。

2)柱后衍生测定

1-脱氧卡巴氧和4-脱氧卡巴氧主要采用HPLC柱后衍生方法测定。Aerts等测定猪肝、肌肉、肾脏中CBX、BDCBX、1-脱氧卡巴氧和4-脱氧卡巴氧残留，采用柱切换HPLC系统-柱后衍生化检测。富集柱为C18 Corasil(60mm×4.6mm，3～5.0um)，流动相为水，流速0.6mL/min；色谱分析柱为C18柱(200mm×3mm，5um)，流动相为0.01mol/L乙酸钠缓冲液(乙酸调节pH6)-乙腈(85+15，v/v)，流速0.5mL/min；柱后衍生试剂为0.5mol/L氢氧化钠溶液，流速0.3mL/min，衍生化反应管(2m×0.5mm)；420nm检测。时间序列为：0min，进样和淋洗；20min，切换六通阀柱反冲，检测器自动调零；25min，复位六通阀；35min，结束。该方法各药物的LOD为0.5～1μg/kg(CBX)、2～3μg/kg(BDCBX)、1～2μg/kg(1-脱氧卡巴氧和4-脱氧卡巴氧)；回收率在81%～87%之间，CV为4%～10%。但是，在这种色谱条件下，QCA不保留，出峰过早与溶剂杂质峰重合而无法检测。Binnendjk等也采用柱切换HPLC-柱后衍生的方法测定动物产品中CBX及其代谢物。富集柱为Sep-Pak C18(10mm×2.1mm)，流动相为水，流速0.3mL/min；色谱分析柱为Chromaspher C18 (100mm×3mm)，流动相为0.01mol/L乙酸钠缓冲液(乙酸调pH6)-乙腈(86+14，v/v)，流速0.5mL/min；柱后衍生试剂为0.5mol/L氢氧化钠溶液，流速0.23mL/min，衍生化反应管(2m×0.5mm)；390nm检测。时间序列为：0min，进样和淋洗；20min，切换六通阀柱，检测器自动调零；25min，复位六通阀；35min，结束。猪肾、肌肉和肝中CBX的LOD为0.5～1μg/kg，BDCBX为0.5～2μg/kg；回收率为83%～95%，RSD小于14%。该法还适用于d血浆和蛋中CBX的测定，回收率在70%～80%之间。