16.2.2.7分析条件的选择

(1)提取净化条件的优化

在文献的基础上，蜂蜜称样量由6g增加至10g，提取剂仍为乙酸乙酯，并对提取效率进行了实验。在两份10g蜂蜜样品中分别添加浓度分别为甲硝唑1.0μg/mL，洛硝哒唑和二甲硝咪唑均为2.0μg/mL的混合标准工作溶液10μL后，用10mL水充分溶解，再用2×20mL乙酸乙酯提取两次，每次在振荡器上振荡20min。然后按照本方法规定的操作步骤进行净化和测定，同时将提取后的蜂蜜溶液再用20mL乙酸乙酯提取一次并进行测定。结果表明，用2×20mL乙酸乙酯提取两次，就可以将三种硝基咪唑类药物提取完全，第三次提取液中未检测到三种硝基咪唑类药物。结果见表16-11。

表16-11 提取剂效率的实验结果

在本方法的研究中，省略了文献净化步骤中的Oasis HLB固相萃取柱，直接用Carboxylic Acid固相萃取柱净化，以减少三种硝基咪唑类药物的损失，特别是洛硝哒唑的损失。经过实验发现，只用CarboxylicAcid固相萃取柱净化，完全可以将影响三种硝基咪唑类药物测定的杂质净化干净。对CarboxylicAcid固相萃取柱的冲洗剂、洗脱剂的确定和用量进行了试验。将浓度分别为甲硝唑1.0μg/mL，洛硝哒唑和二甲硝咪唑均为2.0μg/mL的混合标准工作溶液10μL加入到2mL乙酸乙酯中，移入Carboxylic Acid固相萃取柱中，分别用乙酸乙酯、乙腈、甲醇和水进行洗脱实验。试验发现，5～10mL乙酸乙酯、乙腈均不能将三种硝基咪唑类药物冲洗下来，而甲醇和水会不同程度地冲洗下来。所以，本方法采用乙酸乙酯和乙腈作为冲洗剂。洗脱剂的试验，对照了甲醇、水和流动相分别做洗脱剂的洗脱效果，通过实验发现，它们单独做洗脱剂的效果都不好，三种硝基咪唑类药物的回收率均不理想。而采用流动相与甲醇二者结合的洗脱效果非常好，但甲醇的比例-定要恰当。对流动相与甲醇的比例进行了试验，试验发现，随着甲醇的加入，回收率逐渐变好，在甲醇+流动相为4+6时，回收率达到最佳，随着甲醇的进一步加入，回收率又逐步降低。结果见表16-12。洗脱剂确定后，对洗脱剂的用量进行了试验，结果见表16-13。经过试验表明，只用2mL洗脱剂就可将三种硝基咪唑类药物洗脱完全。

表16-12 洗脱剂对回收率(%)的影响

表16-13 Carboxylic Acid固相萃取柱洗脱剂用量对回收率(%)的影响

(2)质谱条件的优化

采用注射泵直接进样方式，以5μL/min流速将甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑标准溶液分别注入离子源中，在正离子检测方式下对三种硝基咪唑类药物进行一级质谱分析(Q1扫描)，得到每种硝基咪唑类药物的分子离子峰，对每种硝基咪唑类药物的分子离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子信息，获到三种硝基咪唑类药物的二级质谱图，见图16-6。然后对去簇电压(DP)、碰撞气能量(CE)进行优化，使分子离子与特征碎片离子对强度达到最佳。将质谱仪与液相色谱联机，优化雾化气、气帘气、辅助加热气，离子源温度，电喷雾电压，使每种硝基咪唑类药物离子化效率达到最佳。

图16-6 甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑二级质谱图

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