(2) 净化方法选择和条件优化

试验对比研究了液液萃取法、用silica固相萃取柱、Envi-C18柱、强阳离子交换(SCX)柱和GPC的净化效果。采用液-液萃取法初步去除脂溶性杂质后，再用SCX柱净化，去除干扰效果最好，基线噪音降低，提高检测灵敏度，并获得稳定、满意的回收率。

1) 液-液萃取法初步净化

左旋咪唑易溶于有机溶剂，而盐酸左旋咪唑溶于水。初步净化利用了左旋咪唑和盐酸左旋咪唑的这种溶解性差异，将乙酸乙酯提取液用稀盐酸酸化，将左旋咪唑转化为盐酸左旋咪唑，使其溶于水相，弃去留有脂溶性共提干扰物质的乙酸乙酯层，实现提取溶液的初步净化。该溶液用于下一步的SCX固相萃取柱净化。

2) 盐酸溶液浓度的优化

做了盐酸溶液浓度对左旋咪唑反提效率的优化实验，结果表明，在加入盐酸体积相同的前提下，选用0.05mol/L，0.1mol/L，0.2mol/L，0.5mol/L盐酸做反提效率的对比实验。结果表明，加入0.1mol/L比加入0.05mol/L的平均回收率明显提升，加入0.2mol/L盐酸，平均回收率略有提升，加入0.5mol/L的回收率则略有下降趋势，故选择盐酸溶液的浓度为0.2mol/L。

3) 强阳离子交换固相萃取柱净化

实验优化了SPE小柱的淋洗条件和洗脱体积。一组用3mL水，0.05mol/L盐酸1mL和甲醇3mL淋洗SCX小柱，另一组用3mL水和甲醇3mL淋洗SCx小柱，结果发现，前--组回收率平均高2个百分点。用2mL、3mL、4mL、5mL氨水-甲醇(1+3，v/v)洗脱左旋咪唑。洗脱曲线见图18-3。确定用4mL洗脱液洗脱。

图18-3 左旋咪唑洗脱曲线

(3) 液相色谱-串联质谱测定

1) 液相色谱分析条件优化

选择BEH C18柱为分离柱，柱温30℃，比较了甲醇/水体系作流动相和乙腈/水体系作流动相对牛奶和奶粉样品的分离分析，发现分离效果优劣顺序为用乙腈-0.1%甲酸(15+85，v/v)、乙腈-水(15+85，v/v)，甲醇-0.1%甲酸(15+85，v/v)，甲醇-水(15+85，v/v)；即用乙腈-0.1%甲酸(15+85，v/v)时左旋咪唑与干扰峰分离较好，峰形对称。所以本方法选择乙腈-0.1%甲酸(97+3，v/v)作流动相。以0.25mL/min的流速等度洗脱，左旋咪唑的保留时间为1.12min。

2)质谱条件的优化

采用注射泵直接进样方式，以10μL/min将左旋咪唑的标准溶液注入串联质谱的离子源中。采用正离子扫描方式进行一级质谱分析，在选定的质谱条件下，左旋咪唑的产生稳定的强峰(见图18-4)，确定了准分子离子峰[M+H]+ (m/z205.6)为母离子，优化了电离电压。对被测物的准分子离子碰撞后，进行二级质谱分析，优化了碰撞能量，得到子离子质谱图(见图18-5)，选择m/z91.9和m/z178.9为监测离子，子离子丰度比为4：3，其中m/z91.9为定量离子。此外，还对离子源温度、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量、锥孔反吹气流量等参数进行了优化。

图18-4 左旋咪唑标准溶液-级扫描质谱图

图18-5 左旋咪唑标准溶液二级扫描质谱图

3)液相色谱-串联质谱分析

采用多反应监测模式的超高效液相色谱-串联质谱仪进行分析。在选定的仪器条件下，左旋咪唑标准品的超高效液相色谱-串联质谱图见图18-6。

图18-6 左旋咪唑标准溶液的UPLC-MS/MS的TIC图(左)和MRM质谱图

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