食品中亚硝酸盐与硝酸盐的含量测定

　　一、亚硝酸盐测定

　　（一）目的

　　熟悉食品中亚硝酸盐的卫生标准，掌握食品中亚硝酸盐含量测定的基本方法。

　　（二）原理

　　样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，在与N-1-萘基乙二胺偶合形成紫红色染料后，与标准比较定量。

　　（三）试剂

　　实验用水为蒸馏水，试剂不加说明者，均为分析纯试剂。

　　1.氯化胺缓冲液：1L容量瓶中加入500ml水，准确加入20.0ml盐酸，振荡混匀，准确加入50ml氢氧化铵，用水稀释至刻度。必要时用稀盐酸和稀氢氧化铵调试至pH9.6~9.7.

　　2.0.42mol/L硫酸锌溶液：称取120g硫酸锌（ZnSO4·7H2O），用水溶解，并稀释至1000ml.

　　3.20g/L氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠用水溶解，稀释至1L.

　　4.对氨基苯磺酸溶液：称取10g对氨基苯磺酸，溶于700ml水和300ml冰乙酸中，置棕色瓶中混匀，室温保存。

　　5.0.1%N-1-萘基乙二胺溶液：称取0.1gN-1-萘基乙二胺，加60%乙酸溶解并稀释至100ml,混匀后，置棕色瓶中，在冰箱中保存，一周内稳定。

　　6.显色剂：临用前将0.1%N-1-萘基乙二胺溶液和对氨基苯磺酸溶液等体积混合。

　　7.亚硝酸钠标准溶液：准确称取250.0mg于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水溶解移入500ml容量瓶中，加100ml氯化胺缓冲液，加水稀释至刻度，混匀，在4℃避光保存。此溶液每毫升相当于500μg的亚硝酸钠。

　　8.亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液1.00ml,置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5.0μg亚硝酸钠。

　　（四）仪器

　　1.小型粉碎机

　　2.分光光度计

　　（五）操作方法

　　1.样品处理称取约10.00g（粮食取5g）经绞碎混匀样品，置于打碎机中，加70ml水和12ml2%氢氧化钠溶液，混匀，用2%氢氧化钠溶液调样品至pH8,定量转移至200ml容量瓶中加10ml硫酸锌溶液，混匀，如不产生白色沉淀，再补加2~5ml氢氧化钠，混匀。置60℃水浴中加热10min,取出后冷至室温，加水至刻度，混匀。放置0.5h,用滤纸过滤，弃去初滤液20ml,收集滤液备用。

　　2.亚硝酸盐标准曲线的制备：吸取0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml亚硝酸钠标准使用液（相当于0,2.5,5,10,15,20,25μg亚硝酸钠），分别置于25ml带塞比色管中。于标准管中分别加入4.5ml氯化胺缓冲液，加2.5ml60%乙酸后立即加入5.0ml显色剂，加水至刻度，混匀，在暗处静置25min,用1cm比色杯（灵敏度低时可换2cm比色杯），以零管调零点，于波长550nm处测吸光度，绘制标准曲线。

　　低含量样品以制备低含量标准曲线计算，标准系列为：吸取0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0ml亚硝酸钠标准使用液（分别相当于0,2,4,6,8,10μg亚硝酸钠）。

　　3.样品测定：吸取10.0ml上述滤液（样品处理滤液）于25ml带塞比色管中，其它操作同上。

　　（六）结果计算

　　X1=（m2×1000）/[m1×（V2/V1）×1000]

　　式中：X1-样品中亚硝酸盐的含量，mg/kg;

　　m1-样品质量，g;

　　m2-测定用样液中亚硝酸盐的质量，μg;

　　V1-样品处理液总体积，ml.

　　V2-测定用样液体积，ml.

　　结果的表述应报告算术均数的二位有效数。

　　二、硝酸盐测定

　　（一）目的

　　熟悉食品中硝酸盐的卫生标准，掌握食品中硝酸盐含量测定的基本方法。

　　（二）原理

　　样品经沉淀蛋白质除去脂肪后，溶液通过镉柱或加入镉粉，使其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子，在弱酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N-1-萘基乙二胺偶合形成红色染料，测得亚硝酸盐总量，由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量。

　　（三）试剂

　　1.硫酸镉溶液（0.14mol/L）：称取37g硫酸镉（CdSO4·8H2O），用水溶解，定容至1L.

　　2.0.1mol/L盐酸溶液：吸取8.4ml盐酸，用水稀释至1L.

　　3.硝酸钠标准溶液：准确称取500.0mg于110~120℃干燥恒重的硝酸钠，加水溶解，移入500ml容量瓶中，加50ml氯化胺缓冲液，用水稀释至刻度，混匀，在4℃冰箱中避光保存。此溶液每毫升相当于1mg的亚硝酸钠。

　　4.硝酸钠标准使用液：吸取硝酸钠标准溶液1.00ml,置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，临用时现配。此溶液每毫升相当于10μg硝酸钠。

　　5.氯化胺缓冲液、亚硝酸钠标准使用液、显色剂：配制方法见亚硝酸盐测定。

　　6.镉柱（镉粉）海绵状镉粉的制备：于500ml硫酸镉溶液中，投入足够的锌棒，经3~4h,当其中的镉全部被锌置换后，用玻璃棒轻轻刮下，取出残余锌棒，使镉沉底，倾去上层清液，用水以倾斜法多次洗涤，然后移入粉碎机中加500ml水，捣碎约2s,用水将金属细粒洗至标准筛上，取20~40目之间的部分，置试剂瓶中，用水封盖保存备用。

　　（1）镉柱还原效率的测定：

　　取25ml酸式滴定管数支，向柱底压入1ml高的玻璃棉作垫，上置一小漏斗，将新配制的镉粉带水加入柱内，边装边轻轻敲击柱排出柱内空气；加镉粉至8~10cm高，上面用1cm高的玻璃棉覆盖，上置一储液漏斗。

　　当镉柱填装好后，先用25ml0.1mol/L盐酸洗涤，再以水洗两次，每次25ml,调节柱流速至3~5ml/min.镉柱不用时用水封盖，随时都要保持水平面在镉层之上，不得使镉层有气泡。

　　镉柱每次使用完毕后，应先以25ml0.1mol/L盐酸洗涤，再以水洗两次，每次25ml,很后用水覆盖镉柱。

　　柱先加25ml氯化铵缓冲液，至液面接近海绵镉时，吸取2.0ml硝酸钠标准使用液。经柱还原，控制流速3~5ml/min,用50ml容量瓶接收。加入5ml氯化铵缓冲溶液，液面接近海绵镉时，加入15ml水洗柱，还原液和洗液一并流入50ml容量瓶中。加60%5ml乙酸，显色剂10ml,加水稀释至刻度，浑匀，暗处放置25min.用1cm比色杯，以标准零管调节零点，于波长550nm处测吸光度，根据亚硝酸钠标准曲线计算还原效率（如镉柱还原率小于95%,应经盐酸浸泡活化处理）。

　　（2）镉粉还原效率的测定：

　　镉粉使用前经盐酸浸泡活化处理，再以水洗两次，用水浸没待用。用牛角勺将镉粉加入25ml带塞刻度试管中，至5ml刻度，用少量水封住。吸取2.0ml硝酸钠标准使用液，加入5ml氯化铵缓冲液。盖上试管塞，振摇2min,静止5min,用漏斗颈部塞有少量脱脂棉的小漏斗过滤，滤液定量收集于50ml容量瓶中，用15ml水少量多次洗涤镉粉，洗液与滤液合并。加5ml60%乙酸后，立即加显色剂10ml,加水稀释至刻度，混匀，暗处放置25min.用1cm比色杯，以标准零管调节零点，于550nm波长处测吸光度，根据亚硝酸盐标准曲线计算还原效率。

　　（3）结果计算：

　　X2=（m3×1.232×100）/20

　　式中：X2-还原效率，%;

　　20-硝酸盐的质量，μg;

　　m3-20μg硝酸盐还原后测得亚硝酸盐的质量，μg;1.232-硝酸盐换算成硝酸盐的系数。

　　（四）操作方法

　　1.样品处理硝酸盐测定。

　　2.用镉柱法或镉粉法还原硝酸盐为亚硝酸盐

　　1）镉柱法：经活化的镉柱先加25ml氯化铵缓冲液，至液面接近海绵镉时，准确吸取上述的样品滤液10.0ml,加入镉柱还原。以下按上述7（1）中自"控制流速3~5ml/min"起依法操作。

　　2）镉粉法：准确吸取样品滤液10.0ml,置于盛有高度至刻度为5ml处镉粉的25ml带塞刻度试管中。以下按上述7（2）中自"加入5ml氯化铵缓冲液…"按上述依法操作。

　　注：蔬菜、腌菜类食品中硝酸盐含量较高，可根据样品中硝酸盐的实际含量，将样品溶液稀释至适当浓度。

　　（五）结果计算

　　X3=（m5–m6）×1.232×1000/[m4×（V4/V3）×1000]

　　式中：X3-样品中硝酸盐的含量，mg/kg;

　　m4-样品的质量，g;

　　m5-经镉粉还原后测得亚硝酸盐钠的含量，μg;m6-直接测得亚硝酸盐的含量，μg;1.232-亚硝酸盐钠换算成硝酸盐钠的系数；

　　V3-样品处理液总体积，ml;

　　V4-测定用样液体积，ml.

　　结果的表述应报告算术平均值的两位有效数。