采用高效液相色谱法(HPLC)测定了发酵豆制品中10种生物胺的含量，并测定了部分发酵豆腐制品中生物胺的含量。

　　一、材料与仪器

　　1、试剂与样品

　　腐胺,尸胺,精胺,亚精胺,色胺,2-苯乙胺,组胺,酪胺,胍丁胺,苯甲酰氯,庚胺的纯度均在97%以上。

　　5- 羟基色胺， 纯度 98%;

　　乙腈，色谱级;

　　纯净水;

　　其它试剂均为分析纯级。

　　臭豆腐干样品;白方、红方、青方腐乳。

　　2、仪器

　　高效液相色谱仪配紫外检测器;

　　高速电动匀浆器;

　　大容量离心机。

　　二、试验方法

　　1、标准溶液的配制

　　用0.1mol/L盐酸溶液制备了10种生物胺贮存液(腐胺、尸胺、精胺、色胺、2-苯乙胺、组胺、5-羟色胺、酪胺和胍丁胺)。将10种生物胺贮存液(腐胺、身体碱、精胺、色胺、2-苯乙胺、组胺、5-羟色胺、酪胺、胍丁胺)混合成质量浓度为10 0μg/mL的混合标准溶液。

　　用0.1 mol/L盐酸溶液将1 mg/ml内标庚胺储备液稀释至质量浓度为100 ug/ml的内标工作液中。将所有溶液储存在4℃冰箱中。

　　2、标准曲线的制作

　　将100μg/ml生物胺混合标准品工作液用0.1 mol/L盐酸溶液稀释至80、50、20、10、5、1、0.5和0.1μg/ml。

　　具体的衍生方法为：不同浓度的稀释剂2mL，10 0μL 10 0μg/mL内标工作液，1mL 2 mol/L NaOH，10μL苯甲酰氯，然后旋涡振荡30 s，反应30℃40 min，反应20 min，旋涡振荡30 s。

　　加入2ml饱和nacl溶液终止反应。然后加入3ml乙醚，1000g离心10分钟。除去乙醚层并重复提取过程。将乙醚层并入规格为10 ml的离心管中。干燥氮气，然后溶解在1 ml乙腈(色谱级)中，并用0.45 um脱氟膜过滤。每个样本并行3次。样品在黑暗中保存在4摄氏度的冰箱中，并在24小时内完成检测。

　　3、样品的前处理

　　样品在灰泥中均匀打磨。5.0g置于5 0ml离心管中，内标为2 5 0μL(10 0 0μg/mL庚胺储备液)，然后加入0.4 mol/L高氯酸溶液分散，均相1 min，振荡萃取5 min，静止5 min，然后离心35 min。将培养基移至50 mL瓶中，用20 mL高氯酸溶液再提取，与相应体积瓶合并，用0.4 mol/L高氯酸溶液固定体积，2mL按标准品衍生法处理。在本实验中，每个样品的处理重复三次。

　　4、色谱条件

　　色谱柱：ODS-3 250 mm×4.6 mm ， 5μm ;

　　柱温： 30 ℃ ;

　　流动相A：0.01mol/L醋酸铵溶液;

　　流动相 B ：乙腈;

　　进样量： 20 μL ;

　　紫外检测波长： 254 nm ;

　　色谱工作站。